加拿大一枝黄花多糖提取工艺优化及抗氧化活性研究

张 韬，陈启航，韦海秋，李 苓，方旭波，陈小娥

(1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022；2.浙江国际海运职业技术学院，浙江舟山 316021)

加拿大一枝黄花Solidago canadensisL.是原产北美的一枝黄花属多年生草本植物，又称麒麟草、黄莺。原作为庭院观赏植物引进，因缺乏天敌逸生至野外，成为外来入侵物种[1]。近年来，在上海、南京、浙江、江苏等省迅速繁殖并迅速蔓延，对我国生态系统的多样性和农业生产造成了严重的环境破坏与经济损失[2]。舟山海洋性气候非常适合加拿大一枝黄花的生长，2019 年全市共发生面积979.7 hm2，总体处于轻发状态[3]，但是也需要引起足够重视，若不采取积极有效的措施，将对舟山的生态环境造成严重的破坏。

目前国内外专家学者致力于如何控制加拿大一枝黄花蔓延方法的研究，同时也考察了该植物本身的利用价值。研究表明该植物含有多种有用物质，其中的多糖蛋白具有免疫、延迟衰老、抵抗病毒、抗肿瘤等生理功能[4]。加拿大一枝黄花中已鉴定出的成分包含有多炔、二萜、三萜以及三萜皂苷等类，此外还有酚、黄酮等类以及植物精油等主要成分[5-6]，但关于加拿大一枝黄花多糖的提取及生物活性的研究尚未见报道。提取多糖的方法主要有：热水、酸、碱以及超声等[7-8]，其中热水浸提法溶剂易得，操作方便，便于重复试验，故本研究采用传统热水浸提法[9]提取加拿大一枝黄花多糖。本文运用响应面法确定其最佳提取工艺[10]，同时对加拿大一枝黄花多糖抗氧化活性进行初步研究，旨在为今后大规模开发利用加拿大一枝黄花自然资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

加拿大一枝黄花，采摘于舟山市定海区长岗山。采摘后晒干，用中草药粉碎机将其磨成50 目粉末备用。

抗坏血酸(Vc)，过氧化氢，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)，氯化钠，无水乙醇，无水葡萄糖，浓硫酸，硫酸亚铁，邻苯三酚等，购于南京试剂公司，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DEF-6021 真空干燥箱，上海秋佐仪器公司；DJ-04 粉碎机，北京鑫骉腾达公司；东京理化N-101 蒸发仪，上海亚荣仪器厂；LGJ-10 冷冻干燥机，上海豫明公司；DL-5 离心机，北京华瑞公司；Gold S54 紫外可见分光光度计，上海棱光公司；SHT-3 水浴振荡器，常州亿能仪器厂；HHS 恒温水浴锅，常州亿能仪器厂；DR-3518 酶标仪，无锡华文默克仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 加拿大一枝黄花多糖提取及含量测定

采用热水提取法[11]，取一定量加拿大一枝黄花粉末，置于250 mL 三角锥瓶中，以超纯水为溶剂，按不同的料液比、浸提温度和浸提时间进行水浴浸提。浸提完成后，过滤取上清，收集滤液，得到加拿大一枝黄花多糖提取液。

采用硫酸-苯酚法[12]检测加拿大一枝黄花粗多糖中多糖含量，绘制得葡萄糖标准曲线为Y=0.978 x+0.028(其中Y/A 为吸光度，x/(mg·mL-1)为葡萄糖浓度)，R2=0.997 9。由标准曲线回归方程计算出加拿大一枝黄花多糖提取物的浓度，代入式(1)计算加拿大一枝黄花多糖的提取率。

式中：R 为加拿大一枝黄花多糖提取率，mg·g-1；ρ 为提取液中加拿大一枝黄花多糖浓度，μg·mL-1；v 为加拿大一枝黄花多糖提取液体积，mL；n 为稀释倍数；m 为加拿大一枝黄花粉末质量，g。

1.3.2 单因素实验

称取20 g 加拿大一枝黄花粉末，设定3 个自变量条件：提取温度为60、70、80、90、100 ℃，提取时间为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，料液比为1：15、1：20、1：25、1：30、1：35，进行单因素实验，考察提取温度、提取时间、料液比对加拿大一枝黄花多糖提取率的影响，从而确定最佳提取温度、提取时间、料液比。其中固定因素水平为提取温度80 ℃，提取时间2 h，料液比1：20。

1.3.3 响应面优化实验设计

在单因素实验的基础上采用Box-Benhnken 的中心组合设计对热水浸提加拿大一枝黄花多糖工艺进行优化，响应面优化试验因素和水平表如表1 所示。根据响应面优化设计试验结果进行验证实验，并比较预测多糖提取率与实际多糖提取率。

表1 响应面分析实验因素及水平表设计Tab.1 Independent variable and their levels of response surface methodology

1.3.4 加拿大一枝黄花粉多糖抗氧化活性研究

1.3.4.1 溶液配制

称取25 g 加拿大一枝黄花粉末，按最佳提取工艺进行浸提，浸提结束后，通过抽滤等步骤，放入旋转蒸发仪内。旋蒸后提取到浓缩液100 mL，最后转移至细胞培养皿中，60 ℃烘干得到加拿大一枝黄花多糖样品，-20 ℃保存待用。

加拿大一枝黄花多糖溶液：取一定量的一枝黄花多糖粉末，加去离子水溶解，并依次稀释到100、200、300、400、500 μg·mL-1。

Vc 溶液：称取Vc 固体，加入H2O2进行溶解，并依次稀释到100、200、300、400、500 μg·mL-1。

1.3.4.2 加拿大一枝黄花多糖清除O2-·的能力

取0.5 mL 加拿大一枝黄花多糖溶液，加入2 mL 50 mmol·L-1的Tris-HCl 溶液和0.5 mL 25 mmol·L-1的邻苯三酚，混匀后静置5 min，加0.1 mL HCl 溶液终止反应，然后在560 nm 的位置测量混合液的吸光值，用Vc 做对照，而去离子水作空白对照。根据式(2)对O2-·自由基的清除率进行计算[13]：

式中：A0是空白对照的OD 值；A 是一枝花的粗多糖OD 值。

1.3.4.3 加拿大一枝黄花多糖清除·OH 的能力

取0.4 mL 不同浓度(100、200、300、400、500 μg·mL-1)的加拿大一枝黄花多糖溶液，与0.4 mL 5 mmol·mL-1FeSO4溶液充分混合后，再加入0.4 mL 1% H2O2，并在室温环境中放置1 h 进行反应，等反应完成以后，加入1 mL H2O2，混匀后在510 nm 下测量吸光度[14]，Vc 作阳性的对照组。根据式(3)计算清除率：

式中：A0是空白对照组的OD 值；A 是加拿大一枝黄花粗多糖样品的OD 值。

1.3.4.4 加拿大一枝黄花多糖清除DPPH·的能力

通过酶标仪在517 nm 波长处显示吸光度值，进而计算出样品清除DPPH·自由基的能力[15]，取5 mL浓度值为5 mmol·L-1的DPPH·无水酒精溶液，并将其分别添加到各种浓度值的多糖溶液中(100、200、300、400、500 μg·mL-1)，在室温下震动摇匀，进行30 min 的遮光反应，在517 nm 下测量OD 值，以Vc 浓度(100、200、300、400、500 μg·mL-1)作为阳性对照组，通过公式(4)计算清除率：

式中：A0为空白对照组的OD 值；A1为加拿大一枝黄花粗多糖样品和DPPH·的OD 值；A2为加拿大一枝黄花多糖样品和去离子水的OD 值[14]。

1.3.5 数据处理

本实验使用Design Expert 8.05 软件以及Origin 8.0 软件进行数据分析和处理并绘制作图。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取温度对多糖提取率影响

如图1 所示，当温度在60～90 ℃之间，多糖提取率上升较快，在90～100℃之间，上升缓慢，并且有一定的下降。可以看出，随着提取温度增高，多糖在水中溶解度上升，说明该多糖易溶解在热水中；90 ℃以上溶液温度过高，破坏物质结构，多糖有一定程度降解。结合实际情况，选择浸提温度在90 ℃，此时多糖提取率最高。

图1 提取温度对加拿大一枝黄花多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharides from S.canadensis

2.1.2 提取时间对加拿大一枝黄花多糖提取率的影响

由图2 可知，提取时间在1.5～2.5 h 之间，随着提取时间的增加，提取率呈持续上升的趋势，在2.5 h后，则呈下降趋势。表明多糖含量不能在较短的提取时间内完全溶解在水中，但时间过长，则物质可能长时间在高温环境中，其本身结构遭破坏，多糖有一定程度降解，导致提取率下降。结合实际情况，选择提取时间为2.5h，多糖提取率最高。

图2 提取时间对加拿大一枝黄花多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides from S.canadensis

2.1.3 料液比对加拿大一枝黄花提取率的影响

由图3 可知，料液比处于1：15～1：25 之间时，随着料液比增大，多糖提取率也不断提高，料液比大于1：25 之后，提取率趋于稳定，可知在比例大于1：25 后，对提取率没有明显的影响。可能是因为料液比不高时，样品内多糖没有完全溶解，在料液比到达一定程度时，样品所含多糖完全溶解，提取率趋稳。结合实际情况，选择从料液比为1：25 左右时，多糖提取率最高。

图3 料液比对加拿大一枝黄花多糖提取率的影响Fig.3 Effect of solvent to material ratio on extraction yield of polysaccharides from S.canadensis

2.2 响应面优化试验结果

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken 的中心组合原理设计了17 组实验，结果如表2 所示。

表2 响应面试验设计及结果Tab.2 Response surface method design and test results

根据本次响应面实验数据，粗多糖的提取率用Y 值表示，对变量进行编码分别为X1提取的温度、X2提取时间、X3料液比做回归分析并且建立模型，得到Y 因素的二元回归方程：

根据表3 回归模型方差对结果进行分析。回归分析P 小于0.000 1，为极显著，失拟项P 大于0.05，不显著，这说明实验模型的拟合度较好，说明实验的二次模型拟合度较高，可正确反映各因素与响应值之间的变化关系。极差R2的值为99.8%＞85%，说明该模型有着良好的拟合程度且试验较为准确，数据无严重误差。分析结果显示用该模型分析和预测加拿大一枝黄花多糖的提取工艺具有可行性。从试验数据看出，X1(提取温度)、X2(提取时间)，X3(料液比)对于多糖的提取率影响程度依次为X1＞X2＞X3。

表3 回归模型及方差分析Tab.3 Analysis of variance of regression equation

2.3 响应面法分析两因素的交互影响

图4～6 显示了提取温度、提取时间和料液比这3 个要素的交互影响。

图4 提取温度(X1)和提取时间(X2)的交互作用Fig.4 Interaction effects of extraction temperature (X1) and extraction time (X2)

通过数据分析可知，图5 和图6 与图4 进行比较，响应面斜率较陡，表明提取温度(X1)和料液比(X3)、提取时间(X2)和料液比(X3)的交互作用效果明显，而曲面图4 中的坡面则较缓，说明提取温度(X1)、提取时间(X2)交互的影响不明显。

图5 提取温度(X1)与料液比(X3)的交互作用Fig.5 Interaction effects of extraction temperature (X1) and solvent to material ratio (X3)

图6 提取时间(X2)和料液比(X3)的交互作用Fig.6 Interaction effects of extraction time (X2) and solvent to material ratio (X3)

2.4 验证性试验

在提取温度为90 ℃，提取时间为2.5 h 和料液比为1：25 的情况下，重复了3 次平行试验。测出它的提取率是6.95%，和预测的值（6.806%）相近，说明该回归模型可靠，用响应面方法优化加拿大一枝黄花多糖提取条件具有良好的可操作性。

2.5 加拿大一枝黄花多糖抗氧化活性研究结果

2.5.1 对O2-·自由基的清除作用

超氧自由基是由基态氧接受电子产生的一种氧自由基，特定的自由基会导致人体内脂质过氧化，从而加速人体从皮肤到内脏器官的衰老，可导致皮肤损害、癌症以及心血管疾病等，极大地影响了人们的健康。

由图7 可知，加拿大一枝黄花多糖、VC 均能在一定程度上清除O2-·，且随多糖含量浓度的提升，清除率也会增加，表现出剂量效应的关系。当多糖浓度值达到250 μg·mL-1时，最大的清除率应为61.10%。

图7 加拿大一枝黄花多糖对O2-·清除率的影响Fig.7 O2-·free radical-scavenging activities of S.canadensis polysaccharide

2.5.2 对·OH 自由基的清除作用

羟基自由基是一种很关键的活性氧，它是由氢氧根离子(OH-)丧失了1 个电子后产生的。羟基自由基具有很强氧化能力，其氧化的电位能够达到2.8 V。本质上，其氧化性比氟略低。羟自由基是导致过氧化物破损伤的重要元素。促使它形成的关键要素是具有辐射作用的物理和化学的各种因子。CuCl 可和H2O2进行反应从而产成·OH，而·OH 可与邻菲罗啉发生反应，从而在455～450 nm 下产生发光反应[15]。

由图8 可见，Vc 和多糖对于自由基的清除效果不同。在一定程度上，清除能力会随着多糖含量浓度值的增加而增加，表现出较强的量效关系。当多糖的浓度值达到500 μg·mL-1时，最高的清除率为58.91%。

图8 加拿大一枝黄花多糖对·OH 清除率的影响Fig.8 ·OH free radical-scavenging activity of S.canadensis polysaccharide

2.5.3 对DPPH·自由基的清除作用

DPPH·是较为稳定的一种自由基，呈现为暗紫色的棱柱形状晶体，它的熔点在127～129 ℃之间，吸收的最大波长是517 nm。向DPPH·溶液中添加自由基的去除剂后，溶液的颜色将会慢慢变浅，与单电子进行匹配，且在517 nm 处的OD 值最小，它的变化程度和清除程度呈线性关系，和氧自由基消除水平有关。该方法可用于定性分析一些物质对自由基进行消除的能力。

应用公式进行转换以后，普遍使用清除率来表示，清除率越高，它的抗氧化能力就会越强[8]，如图9 所示，VC 清除DPPH·的能力比加拿大一枝花多糖要稍强。在试验的一定浓度内，呈量效关系。在多糖质量浓度为300 μg·mL-1时，清除率最大值为63.02%。

图9 加拿大一枝黄花多糖对DPPH·的清除率的影响Fig.9 DPPH·free radical-scavenging activity of S.canadensis polysaccharide

3 结果与讨论

本实验通过响应面试验获得加拿大一枝黄花多糖最佳提取工艺是：提取温度90 ℃，2.5 h，液料比1：25。在提取标准下，经过多次重复性实验，得到加拿大一枝黄花多糖平均提取率为6.95%，与模型预测值最大提取率Y=6.806%基本相符合，说明通过响应面来优化加拿大一枝黄花多糖提取工艺具有良好的实际操作性。试验还探究了3 个因素的交互作用对提取速率的影响。结果显示，提取温度和料液比、提取时间和料液比相交互的作用非常明显。此外，实验还证明加拿大一枝黄花多糖具有较好的抗氧化性，对O2-·、·OH、DPPH·的清除率最大值分别为61.10%、58.91%、63.02%，并且随着浓度的增大而增强，呈明显的剂量依赖性关系。本试验为加拿大一枝黄花资源利用和基础研究提供了理论依据。