3 种中草药对悬游双眉虫抗氧化酶活性的影响

吕湘琳，齐红莉，王 茜

(天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384)

在我国水产养殖业中存在很多危害性问题，在众多问题中纤毛虫原生动物引起的危害成为了影响水产养殖的首要因素[1]。目前我国防治此类纤毛虫病害主要采用化学药物以及抗生素类药物等对危害性纤毛虫进行杀灭[2-3]，其大量使用会带来药物残留风险、环境污染等问题，甚至对人类的健康造成威胁[4-5]，因此某些化学药物已被禁用。寻找化学药物及抗生素药物以外的其他安全高效替代控制方法已经成为水产养殖健康发展的关键。大量研究表明，中草药在水产养殖中不仅可以有效地抑制各种病原微生物[6-7]，还可以提高鱼体免疫力[8-10]，并且具有高效、天然、环保、价廉、低残留、易于制备等优点[11-12]。因此，使用中草药杀灭病害性纤毛虫符合水产养殖健康、无公害的要求。

悬游双眉虫Diophrys appendiculata隶属于多膜纲，游仆目，游仆虫科，双眉属[13]，是广泛存在于养殖水体中的优势种[14]。目前对于双眉虫病害多使用高锰酸钾，福尔马林及鲁哥氏液进行杀灭[15]。而关于中草药对悬游双眉虫的杀灭效果未见报道。当生物体在受到外界干扰时，生物体内产生活性氧(ROS)，活性氧的积累会导致氧化应激反应，进一步对生物体造成损伤[16]。因此，机体会启动抗氧化酶防御系统来抵御毒性损伤。其中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是生物体内重要的抗氧化酶，可起到自由基清除剂的作用。由于抗氧化酶活性的变化是由于活性氧的产生而诱导的，其可作为氧化应激毒性的生物标志物。

本试验以养殖中常见的危害种悬游双眉虫为试验动物，研究了槟榔、土槿皮、仙鹤草3 种中草药对悬游双眉虫抗氧化酶活性的影响，分析了SOD、CAT、GPx 的剂量-效应关系和时间-效应关系，利用整合生物标志物响应指数(IBR)评价3 种中草药对悬游双眉虫的毒性效应，旨在为水产养殖中危害性纤毛虫的防治及控制提供基础数据及应用推广。

1 材料及方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

试验用悬游双眉虫由中国海洋大学原生动物学实验室种库惠赠。试验前将悬游双眉虫置于盐度30 灭菌的人工海水中培养，以商业干酵母为食，在28 ℃恒温、光照强度为2 000 lx、光照周期14 L：10 D(即白昼14 h，黑夜10 h)条件下进行扩大培养。

1.1.2 试验用药

试验所用中草药均采购自天津市南开区华瑞大药房。中草药的制备根据聂江力等[17]的方法进行。总蛋白(A045-2-2)、超氧化物歧化酶SOD(A001-1-2)、过氧化氢酶CAT(A007-1-1)和谷胱甘肽过氧化氢酶GSH-Px(A005-1-2)的试剂盒均采购于南京建成生物工程研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 酶样的制备

根据HONG Yazhen，et al[18]和LI Jiqiu，et al[19]的研究方法，将处于指数生长期的悬游双眉虫进行暴露试验、样品制备。将悬游双眉虫经毛细玻璃管吸取到含有设置好的药物质量浓度的处理组中，中草药的浓度根据郑晓楠等[20]的研究设置，各中草药原药液经稀释后得到的具体药物质量浓度分别为：槟榔为0、5.44、10.87、21.74 mg·L-1；土槿皮为0、5.64、11.29、22.57 mg·L-1；仙鹤草为0、11.12、33.35、100.06 mg·L-1。暴露试验在50 mL 的细胞培养瓶中进行，每个细胞培养瓶中的终体积是40 mL，悬游双眉虫的密度为106ind.·L-1，每个处理组设3 个重复，试验持续48 h 每12 h 测定1 次。

暴露于不同中草药后，在每个间隔时间点(12、24、36、48 h)从每个处理组中收集悬游双眉虫细胞，使用隔膜真空泵进行抽滤，收获样品。在粗酶提取的预处理过程中，样品被保存在冰浴中。

1.2.2 抗氧化酶活性测定

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用细胞色素C 还原法[21]，SOD 酶活力单位定义：每毫克组织蛋白在1 mL 反应液中SOD 抑制率达50%时对应的SOD 量为1 个酶活力单位。过氧化氢酶(CAT)活性测定采用钼酸铵法[22]，CAT 酶活力单位定义：每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol 的H2O2的量为1 个酶活力单位。谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性通过NADPH 氧化率测定[23]，GPx 酶活力单位定义：每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中GSH 浓度降低1 μmol·L-1为1 个酶活力单位。总蛋白质含量根据BRADFORD M M[24]的方法测定。具体操作方法参照南京建成试剂盒说明书进行。

1.3 数据分析

抗氧化酶活性数据采用平均值±标准差。数据用Sigmaplot 12.5 作图，使用SPSS 24.0 进行重复测量方差分析(rANOVA)确定药物剂量，处理时间以及剂量-时间相互作用的显著性分析[25]；使用单因素方差分析(One-way ANOVA)确定抗氧化酶活性之间是否存在显著差异(P＜0.05 表示差异显著)。IBR 值的计算根据BROEG K，et al[26]的方法进行。

2 结果

2.1 槟榔、土槿皮和仙鹤草对悬游双眉虫SOD 酶活性的影响

rANOVA 结果表明，除槟榔作用下剂量与时间的相互作用外，其他中草药的浓度以及处理时间对悬游双眉虫SOD 酶活性的影响差异显著(P＜0.05，表1)；悬游双眉虫的SOD 活性剂量-效应反应，总体呈上升至峰值后下降的趋势(倒U 型曲线，图1 A，B，C)。槟榔作用下SOD 酶活性峰值大部分出现在较低浓度组(5.44 mg·L-1)，土槿皮作用下SOD 酶活性峰值在12～24 h 出现在较低浓度组(5.64 mg·L-1)，24～48 h 出现在较高浓度组(11.29 mg·L-1)，仙鹤草作用下SOD 酶活性峰值则出现在较高浓度组(33.35 mg·L-1)。箱型图分析表明(图2 A，B，C)，随着中草药暴露时间的延长，悬游双眉虫SOD 活性的变化均呈先升高后降低的趋势，槟榔、土槿皮作用下的悬游双眉虫SOD 酶活性在24 h 达到峰值，仙鹤草作用下悬游双眉虫SOD 酶活性在36 h 达到峰值。

图1 不同浓度中草药作用下悬游双眉虫的抗氧化物歧化酶(SOD)活性Fig.1 SOD activities in D.appendiculate exposed to different concentrations of Chinese herbal medicines

图2 不同中草药暴露时间下悬游双眉虫的抗氧化物歧化酶(SOD)活性的箱形图分析Fig.2 Box-chart analyses of SOD activities in D.appendiculate exposed to different durations of Chinese herbal medicines

表1 中草药作用下悬游双眉虫抗氧化酶的rANOVA 反应结果Tab.1 Results of rANOVA for responses of D.appendiculate antioxidant enzymes following exposure to Chinese herbal medicines

2.2 槟榔、土槿皮和仙鹤草对悬游双眉虫CAT 酶活性的影响

rANOVA 结果表明，3 种中草药浓度、暴露时间和时间剂量相互作用对悬游双眉虫CAT 活性均有显著影响(P＜0.05，表1)；随着中草药暴露剂量的增加，CAT 活性呈现了显著的剂量-效应关系(图3 A，B，C)，其中土槿皮作用下，24 h 组间CAT 活性持续下降，48 h 组间CAT 活性差异不显著(P＞0.05)。仙鹤草作用下，CAT 活性达到峰值的暴露浓度随暴露时间的增加而升高，在12 h 和48 h 时高浓度组(100.06 mg·L-1)的CAT 活性显著低于对照组。箱型图分析表明(图4 A，B，C)，随着槟榔暴露时间的延长，悬游双眉虫CAT活性呈先上升后下降的趋势，在36 h 达到峰值(P＜0.05)；在土槿皮作用下，随暴露时间的延长，悬游双眉虫CAT 活性下降，峰值出现在12 h(P＜0.05)；仙鹤草作用下，悬游双眉虫CAT 活性随时间无明显变化(P＞0.05)。

图3 不同浓度中草药作用下悬游双眉虫的过氧化氢酶(CAT)活性Fig.3 CAT activities in D.appendiculate exposed to different concentrations of Chinese herbal medicines

图4 不同中草药暴露时间下悬游双眉虫的过氧化氢酶(CAT)活性的箱形图分析Fig.4 Box-chart analyses of CAT activities in D.appendiculate exposed to different durations of Chinese herbal medicines

2.3 槟榔、土槿皮和仙鹤草对悬游双眉虫GPx 酶活性的影响

rANOVA 结果表明，三种中草药浓度、暴露时间和时间剂量相互作用对悬游双眉虫GPx 活性均有显著影响(P＜0.05，表1)。随着中草药暴露剂量的变化，悬游双眉虫GPx 活性总体上呈现先上升后下降的趋势(图5 A，B，C)。在槟榔、土槿皮高浓度组悬游双眉虫GPx 活性显著低于对照组(P＜0.05)。箱型图分析表明(图6 A，B，C)随中草药作用时间变化，槟榔、土槿皮作用下悬游双眉虫的GPx 呈现倒U 型曲线，在12 h 达到峰值(P＜0.05)，仙鹤草作用下虫体GPx 活性逐渐下降，在48 h 达到最低值(P＜0.05)。

图5 不同浓度中草药作用下悬游双眉虫的谷胱甘肽过氧化氢酶(GPx)活性Fig.5 GPx activities in D.appendiculate exposed to different concentrations of Chinese herbal medicines

图6 不同中草药暴露时间下悬游双眉虫的谷胱甘肽过氧化氢酶(GPx)活性的箱形图分析Fig.6 Box-chart analyses of GPx activities in D.appendiculate exposed to different durations of Chinese herbal medicines

2.4 整合生物标志物分析

不同剂量槟榔、土槿皮、仙鹤草胁迫下悬游双眉虫的整合生物标志物水平变化如图7 所示。从剂量效应分析，槟榔作用下悬游双眉虫IBR 值总体上呈现先上升后下降的趋势，在5.44 mg·L-1浓度下达到峰值，土槿皮作用下悬游双眉虫IBR 响应也呈现了相似的趋势，在11.29 mg·L-1浓度下达到峰值，仙鹤草作用下除对照组外，其他浓度组呈现上升趋势，在100.06 mg·L-1浓度时达到峰值。从时间效应分析，槟榔作用下，对照组IBR 值无明显趋势，其他处理组IBR 值随时间呈现先升后降的趋势，均在24 h 达到峰值；土槿皮作用下，除5.64 mg·L-1组外，其他组IBR 值均在24 h 达到峰值，随时间延长呈现下降趋势；仙鹤草处理下，悬游双眉虫IBR 值随时间变化趋势不明显。

图7 不同中草药暴露下悬游双眉虫整合生物标志物响应指标(IBR)的变化Fig.7 Variation of IBR in D.appendiculate exposed to different durations of Chinese herbal medicines

3 讨论

近年来，越来越多的学者使用抗氧化酶作为毒性评估的生物标志物[27-28]，而中草药对纤毛虫抗氧化应激反应的影响鲜有学者研究。目前常被用作生物标志物的抗氧化酶有：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)。SOD 可以催化过氧化物酶体和线粒体中产生的超氧阴离子，将其转化为氧气和过氧化氢[29]；CAT 是1 种具有强大催化功能的抗氧化酶，可以有效降解SOD 歧化生成的过氧化氢，分解过氧化氢并转化为无毒的水和氧气，从而进一步避免机体受到损伤[30]。GPx 是另一种重要的内源性抗氧化酶，用GSH 作为电子供体催化过氧化物，将其转化为水和氧，并与SOD、CAT 一同避免机体受到氧化损伤[31-32]。

本研究中，悬游双眉虫的SOD 活性在3 种中草药作用下总体上呈现先升高后下降的趋势，这与HONG Yazhen，et al[33]研究的随着呋喃西林浓度的增加，扇形游仆虫Euplotes vannusSOD 的活性呈现先上升后下降的趋势相似；李邦平[34]研究的棘尾虫Stylonychiasp.受到轻度Zn2+胁迫时，SOD 的活性升高，而当Zn2+胁迫程度超出了棘尾虫所能接受的范围时，SOD 的活性则会受到抑制，产生细胞损伤，影响了棘尾虫的分裂结果基本一致。上述现象说明，在低浓度中草药作用于悬游双眉虫时，SOD 活性受到诱导升高，以快速清除活性氧来防止机体受到伤害，而高浓度下中草药对悬游双眉虫产生了氧化压力，对生物体产生了危害，从而影响了SOD 的合成。

本研究中，悬游双眉虫CAT 活性在3 种中草药浓度、暴露时间和时间剂量相互作用下均呈现极显著差异(P＜0.01)，因此可作为生物标志物之一。在3 种中草药作用下，悬游双眉虫CAT 活性的剂量-效应关系与SOD 基本相似。槟榔作用下，CAT 活性的时间-效应关系虽然也呈现先上升后下降的趋势，但槟榔作用下的CAT 活性达到峰值的时间比槟榔作用下SOD 活性峰值的时间延后，这与韩现芹等[35]发现PCB153作用下半滑舌鳎Cynoglossus semilaevisCAT 活性诱导相较SOD 活性诱导呈现时间上的滞后性的研究相一致。造成此现象的原因是在中草药胁迫下，虫体SOD 酶将大量超氧阴离子转化成H2O2，而大量H2O2在虫体内积累，进而导致CAT 活性被大量诱导。在土槿皮、仙鹤草作用下，CAT 活性的时间-效应关系总体上呈下降趋势。推测土槿皮、仙鹤草对悬游双眉虫产生了损伤。本研究还发现，高浓度组(22.57 mg·L-1)土槿皮作用下，虫体CAT 活性无显著差异，可能是高浓度的土槿皮破坏了虫体的抗氧化酶系统所致，土槿皮的主要作用成分儿茶素可以增加细胞膜的通透性，造成胞内蛋白质和糖类物质的渗漏，使机体代谢发生紊乱[36]。

本研究中，悬游双眉虫GPx 活性在3 种中草药浓度、暴露时间和时间剂量相互作用下均呈现极显著差异(P＜0.01)，所以GPx 也可作为中草药对悬游双眉虫的毒性的生物标志物之一。在3 种中草药作用下，悬游双眉虫GPx 的活性随浓度呈现先上升后下降的趋势，也印证了SOD、CAT 活性变化的结果。RUAN Yuanyuan,et al[37]研究发现，暴露于苯酚下，扇形游仆虫和多小核草履虫Paramecium multimicronucleatumGPx 活性的剂量响应随苯酚浓度的增加而呈倒U 型曲线，这与本研究结果基本一致。然而高浓度槟榔、土槿皮作用下48 h 悬游双眉虫的GPx 活性显著低于对照组(P＜0.05)，是由于高浓度的槟榔、土槿皮对虫体造成了损伤。多数学者研究发现，在水产养殖中对病害纤毛虫有良好的杀灭作用的有效成分是槟榔的槟榔碱及槟榔次碱[38-40]。

由于不同抗氧化酶活性在中草药作用下既出现诱导情况又存在抑制情况，且不同抗氧化酶对中草药胁迫的响应不同，因此将这几种抗氧化酶指标结合起来，即使用整合生物标志物响应指标(IBR)来进行分析可以更有效地评估药物对纤毛虫的毒性效应[41]。IBR 指数在环境污染检测以及鱼类毒性作用的评估中广泛应用[42-43]。本试验中，仙鹤草作用下悬游双眉虫的IBR 值最高，郑晓楠等[20]研究证实中草药对悬游双眉虫的毒性大小依次为：槟榔＞土槿皮＞仙鹤草，本研究在郑晓楠等人研究的基础上使用产生相同毒性效应的中草药剂量进行试验，发现毒性较低的仙鹤草对悬游双眉虫的抗氧化酶系统影响最显著，孙希[44]也发现仙鹤草中鞣质成分可显著提高小鼠血液中SOD 活力达到抗氧化作用。胡梁及等[45]的研究发现，当中草药作用于患有车轮虫病的金鼓鱼Scatophagus argus时，仙鹤草对车轮虫Trichodinasp.的毒性低于土槿皮和槟榔，这可能是不同的纤毛虫对药物的耐受性不同，但仙鹤草在800 mg·L-1对金鼓鱼仍无毒性，因此仙鹤草可作为最安全的中草药。

4 结论

综上所述，3 种中草药作用下，悬游双眉虫SOD、CAT、GPx 活性变化趋势相似，CAT、GPx 活性的重复测量方差分析均呈现极显著差异，因此CAT、GPx 活性的变化可作为纤毛虫对中草药响应的生物标志物；仙鹤草的IBR 指数总体上高于土槿皮和槟榔的IBR 指数，因此仙鹤草对悬游双眉虫的抗氧化酶活性影响最明显。