气相色谱内标法测定葡萄酒中甲醇

甲醇是酒中的有害成分，人体过多摄入含有甲醇的酒会导致中枢神经系统、眼部损伤和代谢性酸中毒等，因此测定酒中的甲醛含量十分重要。国家标准《葡萄酒》（GB/T 15037-2006）对不同产品类型葡萄酒中甲醇做出限量规定，白葡萄酒和桃红葡萄酒中甲醇的限量为250mg/L，红葡萄酒中甲醇的限量为400mg/L，检测方法采用《食品安全国家标准 食品中甲醇的测定》（GB 5009.266-2016）。由于本实验室使用的色谱柱与国标中的规格不一致，通过试验最终得出适合本色谱柱的分析方法——气相色谱内标法，该方法简化了国标中标准工作液的配置步骤和样品前处理的制备步骤，使得葡萄酒中甲醇测定更加简单、快捷。

一、材料与方法

1.材料与试剂。甲醇标准物质（北京坛墨质检科技有限公司，证书编号：GBW（E）082258b、批号：A2003047、浓度：6000μg/mL）;甲醇纯品标准物质（中国计量院，证书编号：GBW06111、批号：15002）;叔戊醇纯品标准物质（坛墨质检科技股份有限公司，批号：4062003）;色谱纯无水乙醇;实验室用一级水。

2.仪器与设备。6890气相色谱仪（FID检测器）配自动进样器;sp型氢空气发生器;AUY220型岛津分析天平。

3.实验方法。（1）色谱条件。LZP-930白酒分析柱（25m*0.32mm，1.0μm）;柱温箱程序升温：40℃保持7min，10℃/min升温至50℃，保持8min，10℃/min升温至150℃，保持2mim;流速为0.8mL/min，分流比为30：1，进样量为1μL;进样口温度：220℃;FID检测器溫度：250℃;氢气流量：40mL/min，空气流量：450mL/min，氮气尾吹流量：20mL/min。

（2）甲醇系列标准工作液的配置。分别吸取甲醇标准物质（浓度6000μg/mL，规格2mL）0.02mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL于5mL容量瓶中，用40%乙醇溶液定容至刻度，配制成甲醇含量为24mg/L、60mg/L、120mg/L、240mg/L、360mg/L、480mg/L的系列标准溶液，再加入0.10mL叔戊醇标准溶液（20000mg/L），混匀后备用。

为了验证标准曲线的准确性，按照国标配置方法，用甲醇纯品标准物质配置甲醇标准储备液（5000mg/L），分别吸取0.125mL、1.00mL、2.00mL于25mL容量瓶中，用40%乙醇溶液定容至刻度，配置成甲醇含量为25mg/L、200mg/L、400mg/L的标准工作液。吸取5.00mL甲醇标准工作液于试管中，加入0.10mL叔戊醇标准溶液，混匀后备用。

（3）样品的前处理。吸取100mL试样于500mL蒸馏瓶中，并加入50mL水（国家标准中此处加入100mL水），加几颗玻璃珠，连接冷凝管，用100mL容量瓶作为接收器（外加冰浴），并开启冷却水，缓慢加热蒸馏，收集馏出液，当接近刻度时取下容量瓶，置于20℃水浴中恒温，用水定容至刻度（国家标准中此处为待溶液冷却到室温后定容），混匀。取蒸馏后的溶液于5mL容量瓶中至刻度，加入0.10mL叔戊醇标准溶液，混匀后备用。

将样品溶液注入气相色谱仪中，以保留时间定性，记录样品中甲醇和叔戊醇峰面积比值，根据标准曲线得到样品中甲醇的浓度。

二、结果与讨论

1.色谱条件的优化。按照色谱柱说明书上的色谱分析条件，葡萄酒样品中甲醇和其他组分不能得到良好的分离。通过设置不同的程序升温及流速，最终优化了色谱条件，将样品中组分分开。其中，甲醇出峰时间是4.636min，叔戊醇出峰时间是13.212min。

分析甲醇标准溶液时，柱温箱：40℃保持7min，10℃/min升温至50℃，保持8min，采集时间为16mim，组分全部走完。分析葡萄酒样品时，需将样品中全部组分流出，柱温箱：40℃保持7min，10℃/min升温至50℃，保持8min，10℃/min升温至150℃，保持2mim，分析时长为28分钟。其他分析条件如进样口温度、检测器温度、分流比、流速、进样量等不变。做样品走序列时分别编辑甲醇标液和葡萄酒样品各自的分析方法，可以节省很多分析时间。

2.标准曲线的绘制。以甲醇和叔戊醇浓度比为横坐标，甲醇和叔戊醇峰面积的比值为纵坐标，制作标准曲线。根据样品检测需要，甲醇标准曲线浓度范围选择在24-480mg/L，线性回归方程为y=0.5874086x+0.0121842，相关系数r2=0.9996。

3.样品前处理的优化结果。一般测定葡萄酒样品时，酒精度也是必测的参数，两方法前处理的蒸馏过程相似，本方法采用酒精度的蒸馏液测定甲醇。酒精度测定依据《食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》（GB 5009.225-2016）第一法密度瓶法，两方法的取样量、收集蒸馏液体积均为100mL，不同之处是蒸馏前的加水体积和蒸馏液的定容温度，测定酒精度加水50mL，蒸馏液恒温至20℃后定容;测定甲醇加水100mL，蒸馏液恢复至室温后定容。

按照《食品安全国家标准 食品中甲醇的测定》（GB 5009.266-2016）标准中对平行双样精密度的要求，在重复性测定条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值10%。经过实验比对表明，蒸馏时加水的体积不同及恒温至20℃后定容，对甲醇测定结果无显著影响。蒸馏一次可用于测定酒精度和甲醇两个项目，缩短了蒸馏时间，省时省力。测定结果见表1。

4.方法检出限与定量限。以3倍信噪比（S/N=3）确定方法检出限，以10倍信噪比（S/N=10）确定方法定量限，此色谱分析方法下的7.5mg/L甲醇检出限溶液信噪比等于11.9，24mg/L甲醇定量限溶液信噪比等于20.5。由此可得，此分析方法满足标准要求中的检出限与定量限。

5.准确度、精密度和加标回收率。（1）准确度的测定。通过标物比对的方式验证标准曲线的准确性，采用甲醇纯品配置了低、中、高三个水平的甲醇标准溶液25mg/L、200mg/L、400mg/L，经过标准曲线测得的浓度值分别为26.2mg/L、198mg/L、396mg/L，符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404-2008）附录F.5准确度中浓度值在10-1000mg/kg偏差范围<15%。国标方法中先配置到25mL容量瓶中，再吸取一定体积到试管中后加入叔戊醇混匀，操作繁琐，混匀不方便。而本实验的配置方法直接吸取一定量已知浓度的甲醇标准物质直接定容至5mL容量瓶中，后加入叔戊醇混匀，减少一步过程，操作简便、节省时间，且准确度高。

（2）精密度的測定。在本色谱条件下对低、中、高三个水平浓度24mg/L、120mg/L、480mg/L的甲醇标准溶液重复测定6次，以RSD表示，见表2。

（3）回收率的测定。取龙眼桃红葡萄酒样品100mL，分别加入6000μg/mL甲醇标准物质0.50mL、1.70mL，加50mL水蒸馏，测得加标回收率结果符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404-2008）附录F.3回收率，被测组分含量在1-100mg/kg回收率范围在90%-110%。

6.样品测定结果。在优化的实验条件下，对当地不同类型葡萄酒样品中的甲醇含量进行测定，符合《葡萄酒》（GB/T 15037-2006）中的要求，检验结果见表3。

内标法的优点是样品含量不受进样体积的影响，但是要确保加入甲醇标液和样品中的叔戊醇的量是准确一致的。采用自动进样器时进样量相同，理论上标液中叔戊醇的峰面积和样品中的叔戊醇的峰面积是相等的，但实际实验中由于操作或者仪器带来的一些误差，偶尔也会出现两者峰面积差距较大的情况，因此实验过程中要观察样品中内标叔戊醇的峰面积，如果进样量相同时相差较大，势必影响定量的准确性。一般可以将样品中甲醇的峰面积和标准曲线中叔戊醇的面积代入标准曲线，计算出甲醇实际含量，如与仪器测定的含量有显著差别，超出了标准要求的精密度，需要重新制备甲醇样品上机测定。

三、结论

通过试验优化出适合本色谱柱LZP-930白酒分析柱（25m*0.32mm，1.0μm）的葡萄酒分析方法，简化了国标中标准工作液的配置步骤和样品前处理制备步骤，使得实际工作中对于葡萄酒中甲醇的测定更加快捷、方便，缩短了检验时间，节省了人工成本。实验表明，甲醇浓度在24-480mg/L，相关系数达到0.9996，线性的准确度、精密度、加标回收率良好。

作者简介：张越（1987-），女，河北张家口人，大学本科，研究方向为食品检测。