上调miR-210对糖尿病足模型大鼠的干预效果及作用机制研究

聂兴 王雪鹰 安静思

糖尿病足属于糖尿病中一种严重的慢性并发症，主要是由于糖尿病导致患者血管、神经发生病变，因此增加了治疗的难度[1]。有研究指出，在糖尿病足发病过程中，创面组织中的氧化应激、炎性反应会被持续激活，影响创面修复，也是导致糖尿病足患者久病不愈的主要原因，严重的会造成患者截肢[2,3]。目前临床中关于糖尿病足的发病机制尚不明确。微小核糖核酸(miRNA)属于一种高度保守的非编码小分子RNA，在血管新生调节中起到重要的参与作用。有研究指出，miR-210过表达有助于毛细血管状结构产生，通过介导血管内皮生长因子(VEGF)有助于内皮细胞迁移[4]。目前临床中治疗糖尿病足主要通过全身综合治疗原则，给予扩血管、抗凝、降糖、抗菌、改善微循环等，必要情况下进行介入治疗以及骨髓造血干细胞移植等，虽然取得的治疗效果显著，能降低患者的致残率和致死率，但是产生的不良反应较多[5,6]。本文研究上调miR-210对糖尿病足模型大鼠的干预效果及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选取健康、清洁级SD雄性大鼠40只，体重220～260 g，均由河北医科大学提供，动物合格证号：SYXK(冀)2020-002。鼠龄为6～8周。所有大鼠给予常规饲养，自由饮水，黑/白光照交替12 h，温度为20～25℃，湿度为40%～50%。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病足模型建立:40只大鼠随机选取10只为空白组，剩余30只参考唐乾利等[7]建立糖尿病足模型，采用1%的STZ(60 mg/kg)给予腹腔注射，建立糖尿病模型，1周后大鼠血糖>16.7 mmol/L说明模型建立成功，成功27只。使用图章在空白组和模型组大鼠足部部位印矩形标记(3 mm×7 mm)，使用剪刀将大鼠全层皮肤剪除后，剪至筋膜，建立糖尿病足模型。

1.2.2 分组及干预:27只模型大鼠随机分为模型组、阴性对照组、miR-210上调组，每组9只。miR-210上调转染miR-210实现，100nM转染miRNA抑制剂转染miR-210，分为miR-210上调组，阴性对照组使用100nM转染miRNA抑制剂转染无意义序列干预，均由广州锐博公司提供。模型组、空白组2组均给予等体积的0.9%氯化钠溶液干预。4组均连续干预5 d。

1.2.3 miR-210检测:取大鼠尾部静脉血3 ml，3 000 r/min离心10 min，取得上层血清，放置-20℃冻箱内备用。采用实时荧光定量PCR检测：将采集到的100 μl血清加300 μl Trizol震荡混匀静置10 min，加80 μl氯仿再次震荡混匀静置5 min，离心后凝胶离心至管底，加100 μl DEPC水。将标本混合液15 000 r/min，离心处理15 min。提取上清至液转移到含糖原EP管中，加等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃静置2 h。提取白色沉淀加1 ml的75%乙醇，混匀后充分洗涤RNA沉淀，4℃ 7 500 g，离心处理5 min，摒弃上清液。加80 μl DEPC水对RNA沉淀进行溶解，-80℃保存。采用逆转录试剂盒(TaqMan® miRNA Reverse Transcription Kit)逆转成cDNA，严格按照操作说明书进行操作。采用THUNDERBIRD qPCR Mix PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，以外源性cel-mir-39-3p作参照，采用2-ΔΔCT法对miR-210表达水平分析。

1.2.4 创面愈合率统计:观察各组大鼠干预后3 d、5 d 创面愈合情况，通过涤纶投影膜将大鼠创面覆盖，扫描大鼠创面大小，经过图像分析仪计算创面愈合率。创面愈合率=(原始创面面积-残余创面面积)/原始创面面积×100%。

1.2.5 病理组织观察:干预后5 d大鼠麻醉处死后，采集大鼠足部组织，提取后采用0.9%氯化钠溶液冲洗后，将粘附在其表现的异物清除干净，干净纱布将表面水分吸干后制备切片，置于2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，染色15 min后使用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，计算大鼠心肌梗死面积。之后切片经过二甲苯脱蜡后，梯度乙醇水化，苏木精染色5 min，流水冲洗后给予伊红染色30 s，观察。

1.2.6 炎性因子、血管内皮活性相关因子水平检测:酶联免疫吸附法(ELISA)检测：提取标本包被液，对TGF-β 0.1 ml进行适当稀释，进而加到聚苯乙烯反应板各孔中。加盖 4℃ 24 h保存。次日使用洗涤液进行3次全方位洗涤，甩干；各孔内加不同稀释倍数的待检标本0.1 ml，同时增加阳性和阴性对照，置于43℃温箱60 min，移去液体。同上述法则洗涤3次，甩干；各孔内加稀释IL-18、TNF-α、VCAM-1、ET、NO、NOS 0.1 ml，置43℃温箱60 min。移去液体，同前法洗3次，甩干；各孔加底物液0.1 ml，置黑暗处20 min；各孔内加2 mol的IL-18、TNF-α、VCAM-1、ET、NO、NOS 0.05 ml，终止反应。试剂盒购自北京北方生物技术研究所，试验操作严格根据说明书的步骤进行。

1.2.7 VEGF-PI3K/AKT-eNOS表达检测:采用免疫印迹(Western blot)将标本提取液，通过1 000 r/min离心处理后提取沉淀，滴加裂解液、反复冻融后，120 000 r/min离心处理，提取上清液，采用酶标仪检测VEGF、SDF1α、AKT、eNOS蛋白浓度，保存。滴加10%的分离胶，封闭，吸干水分，给予5%的浓缩胶灌注，凝固后，将其在电泳槽中固定，加5 μl Marker、变性蛋白样品，电泳干预30 min，待蛋白分离胶底，结束电泳；转膜成功后将硝酸纤维素膜(Nitrocellulosefilter membrane，NC)膜在5%的脱脂奶粉中封闭固定1 h，加一抗(Notch1、Hes1、HIF-1α 1∶1 000)孵育，经过震荡洗膜后加二抗(Notch1、Hes1、HIF-1α 1∶10 000)，孵育，再次震荡洗膜，使用红外荧光成像系统对结果给予分析。以GAPDH为内参。

2 结果

2.1 4组大鼠miR-210表达比较 模型组、阴性对照组、miR-210上调组miR-210表达均低于空白组；阴性对照组、miR-210上调组miR-210表达高于模型组；miR-210上调组miR-210表达高于阴性对照组(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠miR-210表达比较

2.2 4组大鼠创面愈合率比较 模型组、阴性对照组、miR-210上调组干预后3 d、干预后5 d创面愈合率均低于空白组；阴性对照组、miR-210上调组干预后3 d、干预后5 d创面愈合率高于模型组；miR-210上调组干预后3 d、干预后5 d创面愈合率高于阴性对照组(P<0.05)。4组干预后5 d创面愈合率均高于4组干预后3 d(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠创面愈合率比较

2.3 4组病理组织观察 干预后5 d，空白组创面组织中，具有丰富的毛细血管，管腔大，与创面呈垂直分布未发现中性粒细胞浸润；模型组创面组织有大量的炎性细胞，含有丰富的中性粒细胞，而新生毛细血管数量少，且管腔较小；阴性对照组和miR-210上调组创面组织中可见有不同数量的毛细血管，管径较正常增加，炎性细胞浸润减轻，其中miR-210上调组改善最明显。见图1。

图1 4组病理组织观察(HE染色×200)

2.4 4组炎性因子相关指标比较 干预后5 d，模型组、阴性对照组、miR-210上调组IL-18、TNF-α、VCAM-1水平均高于空白组；阴性对照组、miR-210上调组IL-18、TNF-α、VCAM-1水平低于模型组；miR-210上调组IL-18、TNF-α、VCAM-1水平低于阴性对照组(P<0.05)。见表3。

表3 4组炎性因子相关指标比较

2.5 4组大鼠血管内皮活性相关因子水平比较 干预后5 d，模型组、阴性对照组、miR-210上调组ET水平均高于空白组，NO、NOS水平低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组、miR-210上调组ET水平低于模型组，NO、NOS水平高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-210上调组ET水平低于阴性对照组，NO、NOS水平高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 4组大鼠血管内皮活性相关因子水平比较

2.6 4组大鼠VEGF-PI3K/AKT-eNOS表达比较 干预后5 d，模型组、阴性对照组、miR-210上调组VEGF、SDF1α、AKT、eNOS表达均高于空白组；阴性对照组、miR-210上调组VEGF、SDF1α、AKT、eNOS表达低于模型组；miR-210上调组VEGF、SDF1α、AKT、eNOS表达低于阴性对照组(P<0.05)。见表5，图2。

表5 4组大鼠VEGF-PI3K/AKT-eNOS表达比较

图2 4组大鼠VEGF-PI3K/AKT-eNOS表达比较

3 讨论

糖尿病足发病的主要原因是因为患者长时间高血糖，引起血管病变，导致严重的缺血性及发生，大部分患者伴随侧枝血管形成能力损伤[8]。糖尿病足患者主要的临床表现是患者肢体末端疼痛，伴有感染、溃疡、坏疽等发生，严重影响患者精神和身体健康[9]。因此临床中选择科学的治疗手段对患者来说至关重要。

miRNAs可以与靶基因miRNA结合，参与基因调节过程，在对氧化应激反应以及炎性反应中发挥着重要的作用[10]。miR-210是miRNAs成员之一，在肾损伤、糖尿病以及糖尿病合并血管并发症患者中表达升高，是糖尿病肾病早期诊断的主要生物标志物[11,12]。有研究证实，通过抑制miR-210能避免血管生成，减少内皮细胞迁移[13]。郭勇英等[14]研究也认为，在持续的高血糖状态下，干细胞移植能实现miR-210表示上调，在毛细管状结构形成、内皮细胞迁移中发挥着重要作用。

本研究结果显示，模型组miR-210表达最低，提示在糖尿病足模型中miR-210表达降低。伤口愈合属于一种复杂的细胞反应过程，其中角质细胞、内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等均会被激活，会释放大量的生长因子、趋化因子、细胞因子等，对糖尿病足治疗起到一定的协调和维持作用[15,16]。本研究指出，上调miR-210能提高糖尿病足模型大鼠创面愈合率，从而加快大鼠创面愈合速度。

糖尿病足创面常常有大量的氧自由基生成，对氧化应激反应有一定的介导作用，同时还能促进炎性细胞活化，在创面中浸润，释放大量的炎性细胞因子，对创面修复起到一定的消极影响[17]。IL-18、TNF-α属于一种常见的炎性因子，具有促炎作用，导致炎症级联被放大。VCAM-1属于一种黏附细胞因子，对炎性细胞、内皮细胞黏附有介导作用，参与炎性细胞在创面中黏附、浸润过程[18]。本文研究结果指出，上调miR-210能降低糖尿病足大鼠IL-18、TNF-α、VCAM-1水平，从而抑制炎性反应。

研究证实高糖高脂参与血管内皮损伤过程，主要是因为长时间受高血糖的影响，血管内皮细胞会伴随慢性、免疫性损伤，导致血管中活性物质分泌紊乱，释放大量的ET、血栓素，舒血管物质NO、NOS因子大量减少，导致血管收缩功能失衡，内皮细胞损伤，大量血小板聚集黏附，血液供应不足[19,20]。本研究证实，上调miR-210能降低模型大鼠ET水平，抑制NO、NOS水平，从而改善糖尿病足大鼠血管内皮损伤。SDF1α、NO均属于血管内皮祖细胞(EPCs)迁移、运动成员，有助于EPCs向伤口部位迁移，促进伤口部位新生血管产生，加快伤口愈合[21]。本研究显示，上调miR-210能降低模型大鼠VEGF、SDF1α、AKT、eNOS表达，从而将VEGF-PI3K/AKT-eNOS信号通路激活，参与糖尿病足模型大鼠创面愈合调节过程。

综上所述，上调miR-210能提高糖尿病足模型大鼠创面愈合率，抑制炎性反应，改善血管内皮活性，其作用机制可能与VEGF-PI3K/AKT-eNOS信号通路有关，为临床糖尿病足靶向治疗提供理论依据。