弥漫大B细胞淋巴瘤患者神经生长因子、Netrin-1、脑源性神经生长因子的表达及相关性分析

林道锐 徐璐 陈瑜 郭丽娟 杨慧

弥漫大B细胞淋巴瘤是一种常见的好发于血液系统的恶性肿瘤[1]，是非霍奇金淋巴瘤的常见病理类型[2,3]。弥漫大B细胞淋巴瘤患者常见临床症状有无痛性、进行性的淋巴结肿大，发热，乏力，盗汗等[4]。弥漫大B细胞淋巴瘤最常见累及的部位为胃肠道，胃或者回盲部，其他的部位也常常有发生。该病多见于>60岁的老年人，也可以见于儿童[5]。靶向治疗是近几年兴起的淋巴瘤治疗手段，患者的化疗效果较为可观，且不良反应发生率相对较低，完全缓解率可以达到75%～80%，5年的生存率大约为50%，但每种靶向药物只针对特定的患者群体，在治疗上产生了局限性，所以发掘新型治疗靶点刻不容缓[6]。神经因子在恶性肿瘤的发生和发展过程中扮演着重要角色[7]，神经生长因子在胆管癌和骨肿瘤等恶性肿瘤组织中的表达显著升高，抗神经因子治疗能够有效缓解患者临床症状、促进癌细胞的凋亡，抗神经生长因子信号通路维持着霍奇金淋巴瘤细胞的生存，神经生长因子沉默的霍奇金淋巴瘤细胞凋亡比例显著升高。Netrin-1 是Netrin 家族成员之一，在神经生长、血管生成和免疫反应中均发挥着强大的调控功能[8,9]。脑源性神经生长因子主要位于中枢神经系统能够维持神经元的存活和生长[10]，并在一些恶性肿瘤的增殖和侵袭中发挥着促进作用。本文通过观察神经生长因子、Netrin-1、脑源性神经生长因子在弥漫大B细胞淋巴瘤患者组织的变化，并分析其关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2020年1月至2020年12月来我院就诊的符合诊断标准的弥漫大B细胞淋巴瘤患者60例为研究对象，根据淋巴瘤国际预后指数(IPI)将患者分成低危组(评分≤2)和高危组(评分>2)，每组30例患者；另采取30例慢性淋巴结炎患者活检淋巴组织为对照组。本研究获得医院伦理委员会批准，经患者及其家属同意。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:①病理结果确诊为弥漫大B细胞淋巴瘤；②年龄：16～60。

1.2.2 排除标准:①患有慢性阻塞性肺疾病；②伴随癌症；③患有退行性神经病变和自身免疫性疾病等慢性疾病患者; ④合并脑出血和脑梗死; ⑤合并结核、艾滋病和乙肝病毒感染患者; ⑥长期酗酒;⑦吸毒。

1.3 试剂盒材料 羊血清封闭液、生物素二抗、碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液、苏木精; Ki-67、CD31、NGF、BDNF 和 Netrin-1 一抗; CD4-PE、CD25-FITC; 淋巴细胞分离液。

1.4 免疫组化法检测Ki-67、神经生长因子、Netrin-1、脑源性神经生长因子的表达 收集淋巴标本，4%多聚甲醛固定24 h后，进行石蜡切片。梯度脱水后，加入3%过氧化氢。PBS清洗3次，羊血清封闭液封闭30 min后，滴加Ki-67、NGF、BDNF 和 Netrin-1的一抗，4℃冰箱过夜。缓冲液清洗3遍，加二抗，孵育。再冲洗3遍，加入工作液，孵育。PBS清洗3次后显色，自来水冲洗，苏木精复染，脱水，透明，封片，之后置于显微镜下观察。

1.5 流式细胞术检测调节性 T 细胞比例 收集各组患者治疗前的外周血3 ml，加入3 ml的0.9%氯化钠溶液稀释。加入淋巴细胞分离液上层，梯度离心。取中间的白膜层，0.9%氯化钠溶液清洗3次后，平均分成3份，加入流式细胞学抗体(CD4-PE和CD25-FITC)，避光室温条件下染色20 min。

2 结果

2.1 3组一般资料比较 3组研究对象一般资料在性别比、年龄、体重方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组研究对象一般资料比较

2.2 Ki-67增殖指数变化 低危组 Ki-67较对照组上升；高危组较低危组上升(P<0.05)。见图1，表2。

图1 Ki-67增殖指数变化(×100)

表2 Ki-67增殖指数变化

2.3 神经生长因子、Netrin-1、脑源性神经生长因子表达的变化：与对照组相比，低危组神经生长因子、Netrin-1平均光密度增加(P<0.05)；与低危组相比，高危组神经生长因子、Netrin-1平均光密度增加，差异有统计学意义(P<0.05)；3组脑源性神经生长因子平均光密度比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3，图2。

表3 神经生长因子、Netrin-1、脑源性神经生长因子表达的变化

图2 神经生长因子、Netrin-1、脑源性神经生长因子表达的变化(免疫组化×100)

2.4 Treg细胞比例比较 与对照组比较，低危组Treg比例增加(P<0.05)；与低危组比较，高危组Treg比例增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3，表4。

图3 Treg细胞比例

表4 Treg细胞比例

2.5 相关性分析 神经生长因子与Ki-67、Treg呈正相关(r=0.968或0.859,P<0.01)；Netrin-1与Ki-67、Treg、神经生长因子呈正相关(r=0.964或0.825,P<0.01)；脑源性神经生长因子与Ki-67、Treg、神经生长因子没有相关性(P>0.05)。见表5，图4。

表5 相关性分析

图4 相关性分析

3 讨论

弥漫大B细胞淋巴瘤是发生在淋巴造血系统肿瘤的一种，严重影响机体的造血功能，具有较强的侵袭性与异质性，是发病率较高的恶性淋巴瘤[11,12]。化疗是治疗该病的主要方法[13]。弥漫大B细胞淋巴瘤为一种高度恶性、对化疗相对敏感的淋巴瘤，骨髓抑制是化疗的主要毒副作用之一，它包括贫血、白细胞较少、血小板减少，临床患者多因化疗不能耐受，尤其是老年患者，由于年龄高、体质差，易同时合并心、脑、肾疾病，不能按时、足疗程完成治疗，影响疾病预后。因此，寻找缓解临床症状、改善生存质量、提高生活质量、稳定瘤体、提高机体免疫力、延缓肿瘤发展的治疗方法是目前恶性淋巴瘤治疗的重点。本文通过比较神经生长因子、Netrin-1、脑源性神经生长因子在弥漫大B细胞淋巴瘤患者体内的表达变化并分析其相关性。

相关研究表明，神经生长调节分子能够维持神经正常功能、促进神经损伤修复，还能够调节免疫、细胞保护和促血管生成[14,15]。但肿瘤细胞中神经生长调节分子高表达的机制尚不明确，有猜测称其作用机制可能与肿瘤细胞浸润神经引起神经生长因子及Netrin-1表达增加、肿瘤自身分泌以及肿瘤微环境等有关。现有研究发现，神经生长调节分子能够促进肿瘤的发生和发展。TrkA、p75均是神经生长因子的受体，高表达的神经生长因子和TrkA可以增加癌细胞的侵袭率，且其表达与肿瘤的淋巴结转移、远距离播散、高TNM分期、低分化和低存活率紧密相关[16,17]。本文通过实验发现，弥漫大B淋巴瘤患者组织中神经生长因子的表达明显增加，并且其与癌细胞增殖指数Ki-67具有显著相关性，这提示，我们可以在临床上将神经生长因子作为评估弥漫大B细胞淋巴瘤的分级及预后的指标。另外，神经生长因子还与PI3K/AKT、mTOR等信号通路有密切联系[18]，这些通路都或多或少的与肿瘤细胞的免疫、生物学功能及为环境有关，所以深入挖掘神经生长因子对恶性肿瘤的作用效果及调控机制，对其应用于淋巴瘤的靶向治疗中具有重要临床意义。

Netrin-1是一种轴突导向分子，也是新型的免疫抑制因子，能够促进神经末梢定向生长、显著降低患者的抗肿瘤免疫能力。研究发现，Netrin-1参与多种恶性肿瘤的发生发展，能促使肿瘤细胞增殖、凋亡和促进血管生成等[19]。本文通过实验发现，弥漫大B细胞淋巴瘤患者组织中Netrin-1呈现高表达，并且其与癌细胞增殖指数Ki-67具有显著相关性，这指示Netrin-1与淋巴瘤的发生和发展密切相关，可将其当做另一个重要靶点应用于弥漫大B细胞淋巴瘤的精准治疗。Treg 细胞是哺乳动物体内重要的免疫抑制细胞，具有强大的抑制细胞免疫和固有免疫反应的功能。本文实验发现，患者外周血Treg细胞显著高表达，且与神经生长因子、Netrin-1呈现正相关性，其具体作用机制尚不清楚。脑源性神经生长因子是中枢神经系统内的神经营养因子，在肿瘤细胞的增殖迁移中具有重要作用，所以被广泛应用于抗肿瘤治疗[20]。但本文实验结果表明，其在该病中的变化并不显著，所以其应用于该病的靶向治疗效果可能不是很好。

综上所述，弥漫大B细胞淋巴瘤患者组织中神经生长因子和Netrin-1显著高表达，并且与增殖指数Ki-67密切相关，神经生长因子、Netrin-1与外周血Treg细胞比例显著正相关，这为弥漫大B细胞淋巴瘤患者的靶向检测治疗提供了新靶点，其作用机制尚不明确，还需进一步研究。