人源乳酸菌的筛选鉴定及抗氧化活性研究

王小鹏，闫爽，高亚欣，厉冰玉，姜波，周霞，崔文明

(1.河南农业大学食品科学技术学院,郑州 450002;2.河南花花牛乳业集团股份有限公司 乳工程研究院,郑州 450000)

0 引言

乳酸菌是发酵乳生产的核心原料，它可以利用乳中的碳水化合物、蛋白质、脂肪等营养成分，产生乳酸、风味物质及胞外多糖，赋予发酵乳制品良好的质地、风味和口感[1-2]。乳酸菌还有重要的益生功能，乳酸菌菌株及其代谢产物可提高人体肠道内有益菌群的活性和丰度，具有增强机体免疫力、促进机体生长、降压降血脂、抗衰老等作用[3-5]。研究发现，乳酸菌及其发酵产物通常具有一定的抗氧化作用，能够清除自由基、抑制脂质氧化，是安全的抗氧化制剂，可用于功能性发酵乳制品开发[6-7]。

相对于其它来源的乳酸菌，人源乳酸菌安全性更高，肠道耐受性和定殖能力更强，菌株对宿主益生特异性更显著[8]。同时，不同地域、不同种族的人群肠道微生物的功能、代谢机制并不完全相同[9]。目前，我国乳品行业广泛使用的乳酸菌发酵剂主要来自国外，因为机体、环境等的不同，这些乳酸菌不一定适合中国人的体内环境[10]。

河南省夏邑县2008年即被授予“中国长寿之乡”，是全国内陆平原地区首个获此殊荣的县[11]。本研究首先从夏邑县健康长寿老人粪便中分离出乳酸菌菌株，通过酸、胆盐及H2O2耐受性实验，初筛具有一定耐受能力及抗氧化性的菌株；随后，以DPPH清除能力、羟基自由基清除能力、超氧阴离子清除能力和总还原力为指标，复筛并鉴定适于发酵乳生产的高抗氧化性活性乳酸菌菌株。旨在构建具有地域特色的乳酸菌发酵剂，推动我国乳品工业和乳酸菌产业的良性发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

粪便样品采集自河南省周口市夏邑县百岁健康老人。MRS培养基、Mueller-Hinton琼脂培养基，青岛海博生物技术有限公司；胆盐、邻苯三酚、邻二氮杂菲、铁氰化钾等，阿拉丁试剂（上海）有限公司；微生物生化鉴定管，杭州微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），天根生化科技有限公司；PCR扩增引物，大连宝生物技术有限公司。

1.2 主要仪器设备

ECLIPSE 80i电子显微镜，日本Nikon公司；Biometra TGradient梯度PCR仪，德国Biometra公司；EC3 310凝胶成像系统，美国UVP公司；UV2600型紫外分光光度计，岛津企业管理（中国）有限公司；HVE-50自动高压灭菌器，日本Hirayama公司；SWCJ-2FD超洁净工作台，江苏苏净集团公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集及菌株分离

采集新鲜粪便装入含50%甘油溶液的无菌管中，置于含生物冰袋的泡沫箱中暂存并尽快运回实验室。将样品分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-55个梯度。取各稀释度样品100μL均匀涂布于含1%CaCO3的MRS培养基中，37oC有氧、无氧条件下倒置培养48 h。根据菌落生长形态、溶钙圈大小及颜色的不同，挑取具有明显特征的菌落编号并划线纯化，获得形态一致的单菌落。挑选可能的乳酸菌菌株进行革兰氏染色观察及3%H2O2接触酶反应，选择革兰氏阳性且H2O2接触酶反应呈阴性的菌株，50%甘油中-80oC保存。

1.3.2 菌株的过氧化氢耐受能力分析

参照张俊等[12]的方法并稍作修改，将菌株（体积分数3%）接种于H2O2浓度为1 mmol/L的MRS液体培养基中，37oC恒温震荡培养24 h，稀释涂布平板法计算活菌数，并按公式(1)计算细菌的存活率。空白组不添加H2O2同样处理作为对照。

A1：实验组活菌数；

A2：空白组（无H2O2）活菌数。

1.3.3 菌株的耐酸、耐胆盐能力分析

菌株的耐酸、耐胆盐能力测定参照周晏阳等[13]的方法，将菌液（体积分数2%）分别接种于pH=3.0（0.5 mol/L HCL溶液调整）和0.3%牛胆盐（质量分数）的MRS液体培养基中，37oC恒温培养3 h，稀释涂布平板法计算活菌数，并按公式（1）计算细菌的存活率。

A1：实验组活菌数；

A2：空白组（无HCL及胆盐）活菌数。

1.3.4 菌株不同组分的制备

参照陈明[14]的方法制备菌株的不同组分。菌株接种于MRS液体培养基，37oC培养24 h，4 000 g离心10 min，分别收集上清液和菌体。上清液再次经8 000 g离心5 min，0.22μm微孔滤膜过滤后得到发酵上清液(Fermentation Supernatants，FS)。所得的菌体用无菌水洗涤2～3次，调整密度为1×109CFU/mL，将其平均分为2部分，1部分作为菌体细胞 (Intact Strains，IS)；另1部分中加入溶菌酶（1 mg/mL），37oC培养30 min，随后在冰浴条件下超声破碎(250 W，超声5 s，间隔10 s，共10 min)，8 000 g离心10 min，收集上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，得到无细胞提取物（Cell Free Extracts，CFE）。

1.3.5 DPPH自由基清除能力分析

吸取1 mL样品，加入2 mL的DPPH无水乙醇溶液（0.2 mmol/L）混匀，室温避光静置30 min，8 000 g离心10 min，测定上清液在517 nm的吸光度值[15]。DPPH自由基清除率计算公式为：

A0：等体积无水乙醇代替待测样品，同样处理测得的吸光度值。

A1：实验组吸光度值。

A2：等体积无水乙醇代替DPPH溶液，同样处理测得的吸光度值。

1.3.6 超氧阴离子自由基（O2·）清除能力分析

取3.4 mL Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH=8.2）、0.5 mL邻苯三酚溶液（50 mmol/L），加入1 mL样品，混合均匀后放入25oC的培养箱反应4 min，随后加入0.1 mL的HCL溶液（8 mol/L）终止反应，测定其在325 nm的吸光值[16]。O2·清除率计算公式为：

A0：等体积的水分别代替待测物和邻苯三酚，同样处理测得的吸光度值。

A1：等体积的水代替待测样品，同样处理测得的吸光度值。

A2：等体积的水代替含邻苯三酚，同样处理测得的吸光度值。

A3：实验组吸光度值。

1.3.7 羟自由基（·OH）清除能力分析

取1 mL的邻二氮杂菲（2.5 mmol/L），加入1 mL的PBS（pH=7.4）和0.5 mL样品，混匀后加入1 mL的FeSO4溶液（2.5 mmol/L），随后加0.5 mL的H2O2（20 mmol/L），37oC水浴1 h，检测其在536 nm波长处的吸光度值[17]。·OH清除率计算公式为：

A0：等体积水代替待测样品，同样处理测得的吸光度值。

A1：等体积水分别代替待测样品和H2O2，同样处理测得的吸光度值。

A2：实验组吸光度值。

1.3.8 总还原力的测定

取0.5 mL铁氰化钾（质量浓度1%）、0.5 mL PBS溶液（pH=7.4）和0.5 mL各组分样品，混匀后置于50oC水浴20 min，加入0.5 mL三氯乙酸（质量浓度10%），4 000 g离心10 min。吸取上清液，和FeCl3溶液（质量浓度0.1%）等体积混合，检测其在700 nm波长处的吸光度值[18]。总还原力的计算公式为：

A0：PBS代替待测样品，同样处理测得的吸光度值。

A1：实验组吸光度值。

1.3.9 筛选乳酸菌菌株的鉴定

1.3.9.1 菌株的生理生化鉴定

按照《常见细菌系统鉴定手册》[19]和《伯杰细菌鉴定手册》[20]等文献方法，采用生化鉴定管在37oC下测定菌株的碳水化合物发酵模式。

1.3.9.2 菌株的16S rDNA测序及同源性分析

试剂盒方法提取细菌基因组DNA，随后进行16S rDNA片段的PCR扩增。反应体系30μL：基因组DNA模板3μL，上游引物27F 3μL，下游引物1492R 3μL，ddH2O 6μL，Taq master mix 15μL。反应体系放入PCR仪进行扩增，反应步骤为：变性温度94oC，1 min、复性温度55oC，1 min、延伸温度72oC，1 min；循环30次。

将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，将目的基因片段条带清晰的样品送华大基因科技有限公司进行测序。将测序结果在NCBI网站通过BLAST的方法将各个菌株的基因序列进行比对，通过MEGA 7.0软件使用Test Neighbor-Joining Tree的方法进行系统发育树的构建[21]。

1.4 数据统计

每组实验重复3次，表示为平均值±标准差。采用Excel 2010、SPSS 26.0分析处理数据。利用ANOVA进行显著性分析（Duncan检验，p＜0.05）。

2 结果与讨论

利用MRS琼脂培养基对肠道微生物进行初步筛选，得到表面光滑、边缘完整、革兰氏染色阳性，且H2O2接触酶反应阴性的菌株17株。对其进行耐酸、耐胆盐及过氧化氢耐受能力分析，初筛具有一定肠道耐受能力的抗氧化菌株，结果如表1所示。

表1 酸、胆盐、过氧化氢对分离菌株存活率的影响 %

乳酸菌在氧化胁迫条件下，通常会分泌过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶类，以减轻氧化胁迫对菌株的损伤，提高菌株在氧化应激条件下的存活率，因此过氧化氢抗性可用来初筛抗氧化菌株[16]。在含有1 mmol/L H2O2的MRS培养基中，37oC培养24 h后，不同乳酸菌的存活率为29.68%～84.46%，菌株间H2O2耐受性有较大差异。

耐酸、耐胆盐能力是益生菌能否顺利到达肠道，发挥益生作用的基础条件，菌株间生物酶、脂肪酸的种类、含量不同，以及代谢途径的差异性，导致菌株间

2.1 分离菌株的酸、胆盐、过氧化氢耐受能力

耐酸、耐胆盐能力的差异[22-23]。在pH=3条件下，17株菌株的存活率为14.07%～59.19%；而在含0.3%牛胆盐的液体培养基中，菌株的存活率为2.26%～36.74%。考虑菌株的H2O2耐受能力（存活率＞60%）及酸、胆盐耐受性[14]，选择XM-LS01、XM-BL01、XC-EF05、XJLC03、XJ-LL02等5株菌，进一步分析其抗氧化特性。

2.2 分离菌株的DPPH清除能力

为探究各菌株抗氧化活性的差异性及其根源，根据文献方法[14]，将筛选出的5株乳酸菌分别处理，可得到发酵上清液（CFS）、菌体细胞（IS）和无细胞提取物（CFE）。

1,1二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是一种稳定的自由基，在乙醇溶液中呈紫红色，能够捕捉自由基清除剂的单电子，颜色变浅，其OD517吸光度值变化可反映被检测物质抗氧化能力的强弱，广泛应用于体外抗氧化评价[24]。各菌株不同组分的DPPH清除能力如图1所示。

图1 分离菌株的DPPH清除率

从图1可以看出，5株菌都有一定的DPPH自由基清除能力，不同菌株、同一菌株不同组分之间的DPPH自由基清除能力不同，XM-LS01、XM-BL01菌株具有更强的DPPH自由基清除能力。5株分离菌株的发酵上清液、菌体细胞、无细胞提取物的DPPH清除能力分别为70.45%～89.73%、30.70%～52.17%和9.23%～20.09%，同一菌株DPPH自由基清除能力依次为发酵上清液＞菌体细胞＞无细胞提取物（p＜0.05）。张开屏等[25]研究了6株乳杆菌发酵上清液和菌体细胞对DPPH自由基的清除能力，发现发酵上清液的DPPH自由基清除能力为73.04%～87.37%，是菌体细胞的11.06倍。乳酸菌具有DPPH自由基清除能力可能和菌体分泌的胞外多糖有关，且和胞外多糖的数量呈现出明显的正相关性[26]。

2.3 分离菌株的羟基自由基（·OH）清除能力

羟基自由基（·OH）是重要的活性氧物质之一，具有极强的氧化能力，能够增强细胞膜通透性，损伤DNA和多糖分子，造成细胞损伤。本研究分析了5株乳酸菌的发酵上清液（CFS）、菌体细胞（IS）和无细胞提取物（CFE）对羟基自由基的清除能力，结果如图2所示。

从图2中可知，5株菌都有一定的羟基自由基清除能力，不同菌株、同一菌株不同组分之间的羟基自由基清除能力不同，XM-LS01、XM-BL01菌株具有更强的羟基自由基清除能力。5株分离菌株发酵上清液、菌体细胞、无细胞提取物的羟基自由基清除能力分别为20.73%～35.28%、28.43%～63.54%、和35.17%～66.17%。同一菌株的菌体细胞和无细胞提取物的羟基自由基清除能力无统计学差异（P＞0.05），但均显著高于发酵上清液（P＜0.05），表明5株菌株的羟基自由基清除能力主要来自于菌体表面及菌体细胞内物质，而不是来自于菌株生长过程中的代谢产物。有研究表明，乳酸菌能够和Cu2+、Fe2+等金属离子鳌合，减少羟基自由基的产生，但具体的鳌合机制还有待进一步研究[27]。

图2 分离菌株的羟基自由基清除率

2.4 分离菌株的超氧阴离子自由基（O·2）清除能力

超氧阴离子自由基（O2·）经金属离子催化后，发生Fenton反应，生成高活性的羟基自由基，引发体内脂类过氧化，加速机体衰老过程。5株分离菌株对超氧阴离子自由基清除能力如图3所示。

图3 分离菌株的超氧阴离子自由基清除率

如图所示，5株菌均有一定的超氧阴离子自由基清除能力，但不同菌株之间、同一菌株不同组分之间的超氧阴离子清除能力有差异，XM-LS01、XM-BL01菌株具有更强的超氧阴离子自由基清除能力。5株菌发酵上清液、菌体细胞、无细胞提取物的超氧阴离子自由基清除能力分别为73.46%～88.95%、22.22%～34.03%和32.52%～53.55%。同一菌株的超氧阴离子自由基清除能力依次为：发酵上清液＞菌体细胞＞无细胞提取物（P＜0.05），表明菌株超氧负离子清除能力主要来自于代谢产物中。乳酸菌生长过程中，代谢产生的各种氧化酶类，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶，使其具备了清除超氧阴离子自由基的能力[28]。

2.5 分离菌株总还原力

总还原力测定是反映抗氧化物质提供电子能力大小的重要指标之一，5株分离菌株的总还原能力如图4所示。

图4 分离菌株的总还原力

如图4所示，不同菌株、同一菌株不同组分间的总还原力有差异，XM-LS01、XM-BL01菌株具有更高的还原能力。5株菌发酵上清液、菌体细胞、无细胞提取物的总还原力为30.47%～51.86%、19.96%～43.82%和11.03%～23.62%。同一菌株中，总还原力依次为：发酵上清液＞菌体细胞＞无细胞提取物。菌株的总还原力可能源自菌体中的抗氧化成分及代谢产物中的蛋白质，而超声破碎会导致部分细胞内抗氧化成分失活[26,29]。

2.6 高抗氧化菌株的生理生化鉴定

将DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除能力及总还原力较强的XM-LS01、XM-BL01菌株菌株进行生理生化鉴定。

XM-LS01和XM-BL01菌株革兰氏反应阳性，H2O2接触酶实验阴性，糖发酵结果如表2所示，参考《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》，XM-LS01与清酒乳杆菌鉴定特征接近，XM-BL01与动物双歧杆菌特征接近。

表2 XM-LS01和XM-BL01菌株的生理生化鉴定结果

（续表2）

2.7 高抗氧化菌株的16S rDNA测序及同源性分析结果

提取2株待测菌的基因组DNA，用16S rDNA通用引物（27f/1492r）进行PCR扩增，扩增产物的琼脂糖电泳图如图5所示。可知在1 500 bp左右出现条带，且无明显拖尾，表明PCR扩增成功，可用于后续分析。

图5 XM-LS01和XM-BL01菌株的PCR扩增电泳图

在NCBI数据库中，将碱基序列进行BLAST比对，利用MEGA7.0构建系统发育树进行同源性分析，结果如图6所示。

XM-LS01与Lactobacillus sakei subsp.sakei strain DSM 20017的同源性为99.64%，16S rDNA基因序列比对中，属于同一个属的最小同源性为92.10%，属于同一物种的最小同源性为99.21%，结合生理生化鉴定结果，可以判定菌株为清酒乳杆菌。XM-BL01与Bifidobacterium animalis subsp.lactis strain YIT 4121的同源性为99.58%，16S rDNA基因序列比对中，属于同一个属的最小同源性为91.76%，属于同一物种的最小同源性为98.34%，结合生理生化鉴定结果，可以判定菌株为动物双歧杆菌。

图6 XM-LS01和XM-BL01菌株的16S rDNA系统发育树

3 结论

从健康百岁老人粪便中分离出17株菌株，通过酸、胆盐和H2O2耐受性分析，得到5株高耐受性乳酸菌。以DPPH清除能力、羟基自由基清除能力、超氧阴离子清除能力和总还原力为指标，分析5株菌不同组分的抗氧化能力可知，不同菌株、同一菌株不同组分之间的抗氧化能力不同，无细胞提取物的羟基自由基清除能力较高，而发酵上清液有更强的DPPH自由基清除能力、超氧阴离子清除能力和总还原能力。通过形态学、生理生化和16S rDNA鉴定分析，抗氧化活性较高的XM-LS01和XM-BL01菌株分别为清酒乳杆菌和乳双歧杆菌。