云南乳饼副产物中乳糖和乳清蛋白的提取利用

邹丽蓉，谢蕊，杨依然，王雪峰,2，普岳红,2，董文明，黄艾祥

（1.云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201；2.云南省畜产品加工工程技术研究中心，昆明 650201）

0 引言

乳饼作为云南特色乳制品，每10 kg生鲜乳只能生产出1 kg乳饼，剩下的副产物-乳清水并没有得到合理利用，造成大量的乳清蛋白和乳糖资源浪费[1-2]。乳清水中含有的蛋白质资源如乳铁蛋白、乳球蛋白等，对人体免疫功能产生巨大影响[3-4]。乳糖也是乳清水中的主要成分，其质量分数能够达到60%以上[5]。

近年来，国内外对乳清的开发和应用都十分重视，韩春然等[6]研究了微生物转谷氨酰胺酶催化大豆乳清蛋白聚合的条件。Tu与李雪等[7-8]分别以大豆乳清水为原料开发大豆乳清饮料。本实验以乳清水为原料，提取乳糖和乳清蛋白，将乳糖添加到酸奶中进行发酵，乳清蛋白通过酶解技术制备出具有一定抗氧化活性的酶解物，从而提高乳清水的综合利用率。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 原料

乳清水，昆明市晋宁区乳饼加工厂；全脂奶粉，白砂糖，市售；直投式菌种，青岛汉森菌业有限公司。

1.1.2 试剂与设备

JJ500电子天平，常熟双杰测试仪器厂；TGL20M型高速冷冻离心机，北京中兴伟业仪器有限公司；SCIENTZ-18N型真空冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司；UFSC40001型搅拌式超滤装置，上海摩速有限公司；NDJ-4型旋转式黏度计，武汉格莱莫检测设备有限公司；SVJ-358型智能商用酸奶机，北京世纪阳光有限公司；DHP-9052型电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；雷磁PHSJ-4A型pH计，上海精密科学仪器有限公司；DSX-280OKB24型手提式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；GYB60-6S型高压均质机，上海东华高压均质机厂。

氯化钙（食品级）、氯化钠、氢氧化钠（食品级）、磷酸氢二钠、硫代硫酸钠、氢氧化钠、乙酸铅、碘、碘化钾、甲基橙、可溶性淀粉、草酸钾、酚酞指示剂、95%乙醇、铁氰化钾、磷酸二氢钾、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、三氯乙酸、盐酸、三氯化铁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、以上试剂均购于天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳糖的提取工艺流程

乳清水→脱脂纱布过滤→加入氢氧化钠（质量浓度400 g/L）调节pH值至7.5→按比例（12 g/L）加入氯化钠（浓度1 moL/L)→放入水浴锅加热（65℃，15 min)→离心（4 000 r/min，30 min）→粗滤→微滤（0.22μm有机膜）→超滤(30 ku的PES超滤膜)→滤液冷冻干燥→乳糖冻干粉

1.2.2 乳清蛋白的提取工艺流程

参照雷静等[9]的方法进行一定的调整。

量取1 L乳清水→加入浓度为1 mol/L的HCl（或质量浓度为400 g/L的NaOH溶液）调至pH值7.5→在60℃条件下，加入添加量为12 mL的CaCl2（浓度1 mol/L）水浴搅拌15 min→冷却出现絮凝除去酪蛋白和乳脂→4℃转速4 000 r/min离心30 min→粗滤除沉渣→采用0.22微孔膜微滤→用10 ku超滤取上清液→透析脱盐处24 h→真空冷冻干燥→放入4℃冰箱保存备用

1.2.3 乳清水中乳糖和乳清蛋白的提取条件优化

1.2.3.1 乳糖提取实验

（1）原料温度对乳糖提取速率的影响。在料液比为1∶1，压力为0.30 MPa，温度梯度40、45、50、55、60℃的条件下；用30 ku的PES超滤膜提取乳糖，以膜通量为指标考察超滤过程中原料温度对乳糖提取速率的影响。

（2）超滤压力对乳糖提取速率的影响。在料液比为1∶1，原料温度为55℃的条件下，压力梯度为0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 MPa；用30 ku的PES超滤膜提取乳糖，以膜通量为指标考察超滤过程中超滤压力对乳糖提取速率的影响。

（3）料液比对乳糖质量分数的影响。控制超滤压力为0.30 MPa、原料温度为55℃，料液比设置为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1，用30 ku的PES超滤膜提取乳糖，以乳糖质量分数为指标考察料液比对乳糖质量分数的影响。

1.2.3.2 乳清蛋白提取实验

（1）不同pH值对蛋白质絮凝效果的影响。控制CaCl2添加量为15 mL，水浴温度为40℃，pH值设置为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，取1 L的乳清水，用HCl或NaOH调pH值，研究不同pH值对蛋白质质量分数的而影响。

（2）絮凝剂CaCl2的添加量对蛋白质絮凝效果的影响。控制pH值为7，水浴温度为40℃浓度为1 mol/L的CaCl2的添加量设置为9、12、15、18、20 mL；取1 L的乳清水，研究CaCl2的添加量对蛋白质质量分数的影响。

（3）水浴温度对蛋白质絮凝效果的影响。控制pH值为7，CaCl2溶液（浓度1 mol/L）的添加量为15 mL；水浴温度设置为20、30、40、50、60℃；取1 L的乳清水，研究水浴温度对蛋白质质量分数的影响。

1.2.4 乳糖提取物在酸奶中的应用

1.2.4.1 酸奶加工工艺流程

全脂奶粉→调配（温水调配）→复原乳→添加白砂糖（质量分数8%）→均质（8～10 MPa）→灭菌(巴氏杀菌85℃,15 min)→冷却（30～45℃）→接种（接种量0.2%）→发酵（43℃）→冷藏后熟（2～4℃）

1.2.4.2 酸奶发酵实验

用乳糖提取物冻干粉代替质量分数为50%蔗糖，按照1.2.4.1酸奶加工工艺进行酸奶制作，并进行感官评价和相关理化指标测定。

1.2.5 乳清蛋白提取物的酶解实验

称取一定量的乳清蛋白提取物冻干粉，按一定的质量比（1∶30）加入去离子水于烧杯中溶解乳清蛋白，混合均匀后分别添加4%的4种蛋白酶在各自的最适温度、pH值条件下（见表1）酶解5 h（每0.5 h测一次pH值，保持pH值不变）。待酶解结束后立刻置于95℃灭酶10 min,在4℃转速为4 000 r/min离心30 min,过滤收集上清液,放入-20℃冰箱保存备用[10-11]。

表1 不同的蛋白酶最适条件

1.2.6 指标测定

1.2.6.1 乳糖质量分数测定

参照伍桃英等[12]方法，采用碘量法测定乳糖质量分数。

样品的预处理：准确称取(1±0.0001)g乳糖粉溶解、定容至250 mL,加人4 mL草酸钾一磷酸氢二钠溶液和4 mL质量分数20%的乙酸铅、摇匀后静置，用滤纸过滤,初滤液舍弃,续滤液备用。

样品测定:移取滤液25.00 mL于碘量瓶中，分别加入1滴0.1%甲基橙、7.50 mL浓度为0.5 mol/L的NaOH和25.00 mL浓度为0.1 mol/L碘液，摇匀后加塞液封置暗反应30 min，加人8.00 mL浓度为0.5 mol/L的HCl摇匀，用标准Na2S2O3溶液滴定，变黄后滴加3滴1.0%的淀粉指示剂，摇匀继续滴定至淡粉色，静置30 s不变色，记录消耗Na2S2O3的体积,同时做平行与空白。

乳糖质量分数计算[12]：

式中：V空为滴定空白消耗Na2S2O3的体积（mL)；V样为滴定样品消耗Na2S2O3的体积（mL)；C样为Na2S2O3的浓度（mol/L)；m样为样品质量（g)；V滤液为移取样品滤液的体积（25 mL）；V总为总体积（250 mL)；0.18为乳糖换算系数。

1.2.6.2 蛋白质质量分数的测定

参照国标GB 5009.5-2016中的凯氏定氮法，测定蛋白质质量分数。

1.2.6.3 酸奶理化指标的测定

酸度（°T）测定参照GB 5009.239-2016；黏度的测定：将酸奶装在直径大于70 mm的玻璃烧杯中，保持酸奶温度在室温范围内，用旋转黏度计4号转子测定，转速为30 r/min经过多次旋转，20～30 s进行读数，测量3次取平均值；pH值测定：pH计直接测定；持水率的测定：参照Hassan[13]的方法，取15～20 g样品，10℃下转速为13 500 r/min离心30 min,过滤后称沉淀物的质量，所得持水率=离心沉淀物质量/样品质量×100%；感官评定：参考GB 19302-2010，邀请10人对两种酸奶进行感官评分计算平均值。

1.2.6.4 乳清蛋白酶解物水解度的测定

在96孔酶标板中分别加入4种酶解液2.5μL和OPA混合液100μL，然后在340 nm的波长下25℃反应8 min后测酶解液的吸光度。求出各个酶解液中肽的质量分数。用pH值为7.0浓度为1.0 mmol/L的PBS配制质量浓度为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL的GSH作为标准绘制多肽质量分数的标准曲线[14-15]。水解度为[14]

1.2.6.5 乳清蛋白酶解物DPPH清除能力的测定

DPPH自由基清除能力测定是参照文献的方法[16]。准备浓度为0.2 mol/L的DPPH溶液和体积分数为70%的乙醇溶液待用。分别在96孔板上加入1 mL的DPPH与1 mL样品溶液混合均匀避光反应30 min（室温下），记为A1；将1 mL体积分数为70%乙醇溶液与1 mL样品溶液反应液混合均匀作为对照组，记为A2；以1 mL的DPPH与1 mL体积分数为70%乙醇溶液作为空白组，记为A0。测定分析在517 nm波长下不同样品液的吸光值。按式（2）计算DPPH自由基清除率，即[16]

式中：A0为空白组样品的吸光值；A1为实验组样品的吸光值；A2为对照组样品的吸光值。

1.2.6.6 乳清蛋白酶解物还原能力测定

取1 000μL各个酶解液中，再分别加入2 500μL铁氰化钾溶液（质量分数为1%）和2 500μL pH值6.6的磷酸盐缓冲液（浓度为0.2 mol/L），混合均匀后保温20 min（50℃水浴条件下），加入三氯乙酸（质量分数为10%）2 500μL，混合均匀后在3 000 r/min的 转速下离心10 min，取上清液2 500μL，随后加入2 500μL蒸馏水和2 500μL三氯化铁（质量分数为0.1%）混匀，从每个样品液中取出200μL分别加入到96孔板中，于700 nm检测波长下溶液反应10 min后测定其吸光值，记为A1;以缓冲液替代样品液作为空白对照，记为A0[17]。

所有样品进行3组平行重复，结果表示为平均值±标准偏差，用SPSS11.5软件进行方差分析和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 乳糖的提取实验

由图1（a）可以看出，膜通量随着超滤压力的增加而增加，当压力到达0.35 MPa后，膜通量逐渐减小。原因是在超滤过程中产生了浓差极化和膜压实，使膜表面形成凝胶层，增大了物料通透阻力，增厚的凝胶层与压力作用部分抵消使得膜通量减小[3]。因此本实验中0.35 MPa为乳糖超滤的最适压力。由图1（b）可知，原料温度越高膜通量也越大，其原因是温度升高，乳清水黏度降低，超滤膜表面孔隙扩大，膜通量也越来越大。随之时间推移，原料温度逐渐下降，乳清水逐渐变黏，膜通量也随之下降。在60 min左右各温度下的膜通量差距不大，为了合理利用其中的乳清蛋白，防止温度过高使乳清蛋白变性和微生物增长、提高乳糖提取速率[18]，本研究选取55℃为超滤原料初始温度。由1（c）可以看出，当料液比为1∶3(体积比)的时，获得的乳糖质量分数最大，随着料液比的减小，乳糖的质量分数减少，其主要原因是因为超滤不充分，部分乳糖还存在于上清液中。但料液比在1∶2（体积比）和1∶3(体积比)条件下，提取的乳糖量差异不大，为减少耗能，节省工艺时间，本实验控制料液比为1∶2，测得乳糖质量分数为68.22%。

2.2 乳清蛋白的提取

随着温度的升高，溶液形成的絮凝容易沉淀。由于乳清蛋白在热和酸的作用下极易变性，属于一种敏感性的蛋白质。由图2（a）可以看出，温度为20～60℃的蛋白质质量分数波动比较大，因此温度的变化对蛋白质质量分数的影响比较大，也局限了乳清蛋白的加工方式。由图2（b）得出，pH值在6.5～7.5的环境中出现絮凝现象较为明显，这是因为pH值的变化伴随着乳清中的Ca2+的变化；而当pH值为8时，碱性条件下絮凝减少，同时随着乳清水pH值的上升，乳清蛋白变性加剧，使得蛋白质质量分数降低。由于CaCl2的添加导致乳清水中的磷酸和磷酸盐发生絮凝或沉淀。由图2（c）可以看出，当1 L乳清水中浓度为1 mol/L的CaCl2的添加量达到18 mL时，蛋白质质量分数下降快，蛋白质发生变性。而当添加量在12～18 mL时，蛋白质质量分数变化不大。因此，1 L乳清水中CaCl2添加量应控制在12～18 mL范围内比较合适。

由图2可以看出，pH值在6.5～7.5；CaCl2的添加量在12～18 mL；温度处在40～60℃的范围内，确定pH值为7.5、CaCl2的添加量为12 mL和水浴温度为60℃作为最优条件，乳清蛋白质量分数达到39%。

图1 不同单因素对乳糖质量分数的影响

图2 不同单因素对蛋白质絮凝效果的影响

2.3 酸奶相关理化指标

2.3.1 酸奶感官评价

对普通酸奶和添加乳糖粉的酸奶进行感官评分，评分结果平均值如图3所示。由图3可以看出，添加乳糖冻干粉的酸奶与普通酸奶相比，其酸甜比以及黏稠度出现明显提高，奶香味和组织状态略微提升，酸奶风味出现略微下降。说明乳糖粉的添加对酸奶发酵有一定的影响，且能够改善发酵乳的品质特性，提高酸奶的感官评分。

图3 酸奶感官评分

2.3.2 酸奶相关理化指标

使用提取的乳糖提取物冻干粉所发酵制成的酸奶与普通酸奶的理化指标如表2所示。由表2可以看出，经过相同的发酵工艺过程，添加乳糖提取物冻干粉的酸奶pH值为4.25、酸度为101°T，比普通酸奶略高；添加乳糖冻干粉的酸奶比普通酸奶黏度增加了2 400 mPa·s；添加乳糖提取物冻干粉的酸奶的持水率为79.4%，比普通酸奶高13.2%，说明乳糖的添加对酸奶的品质有一定影响。

表2 普通酸奶与添加乳糖冻干粉酸奶的理化指标测定

2.4 乳清蛋白酶解效果

将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胃蛋白酶4种酶分别在最适的pH和温度下对乳清蛋白进行酶解。由图4中水解度和图5 DPPH清除能力、总还原能力的综合比较，胃蛋白酶作为本实验的酶得到的DPPH和水解度最高，因此胃蛋白酶是最佳选择。胃蛋白酶是一种消化酶，进行水解可以缓解人体内对酶解产物的影响[19]。4种水解酶中胃蛋白酶酶解乳清蛋白后水解度为24%，DPPH清除能力64%，还原能力0.25。

图4 不同蛋白酶酶解物水解度比较

图5 不同蛋白酶酶解物抗氧化能力比较

3 结论

本实验以乳饼加工产生的副产物—乳清水为原料，通过微滤、超滤等技术对乳清水中的乳糖、乳清蛋白分别进行提取，乳糖提取物中乳糖质量分数为68.22%，乳清蛋白提取物中蛋白质质量分数为39%。所得乳糖提取物加工形成的酸奶，获得的发酵乳pH为4.25、酸度为101°T，黏度为7 800 mPa·s、持水率为79.4%、感官评分为88，组织状态良好、呈乳白色、具有发酵乳特有香味且酸甜适口。将乳清水中的另一提取物乳清蛋白进行质量分数的测定，最终测定蛋白质的质量分数为39%，用胃蛋白酶酶解乳清蛋白粉得到的蛋白酶解物抗氧化活性较高，并对其抗氧化能力进行测定，其水解度为24%、DPPH清除能力64%、还原能力0.25。该研究为乳糖、乳清蛋白的提取利用提供参考，进一步提升了乳饼加工副产物的综合利用率。