环境压力对益生菌冲剂活性的影响

莫景康，黎绍基

（广州工商学院，广东广州 510000）

益生菌是指寄生在人体内，与人体形成共生关系并对人体健康有利的微生物。常见的益生菌有乳杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌以及球菌等[1]。益生菌能在宿主肠道内定植并产生乳酸、细菌素和过氧化氢等物质，抑制肠道内的有害微生物，促进宿主肠道健康。目前，它们被广泛应用于食品和医药领域[2-3]。

益生菌在食品生产过程中和进入消化道后都可能经历各种环境压力，因此良好的环境压力耐受性对益生菌至关重要。靳志强等[4]采用MRS培养基模拟胃酸环境以及胆盐环境，分离提取出一种可以承受pH=3的环境以及胆盐浓度为0.3%的环境的植物乳杆菌。李利等[5]从酸奶中分离出的2株乳杆菌具有优良的抗酸性以及抗胆盐能力。李一娟等[6]发现从健康家禽新鲜粪便中分离出来的罗伊氏乳杆菌在经过 pH=2.5、1.5 g·L-1胆盐以及 1 mmol·L-1H2O2接种处理6 h后，活菌数基本能维持初始浓度。

为了解市面上的益生菌冲剂所含的益生菌在不同环境压力下的活性，本研究以市场上在售的3种益生菌冲剂产品为研究对象，检验其中的益生菌对酸、胆盐以及抗氧化性压力的耐受性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

将有效期内的3种益生菌冲剂产品（表1）接种于MRS液体培养基中，于37 ℃培养活化，每24 h传代。实验时将OD在0.5～1.0的3种细菌培养液在4 000 r·min-1离心10 min，离心后去掉上清液，用生理盐水悬浮，重复以上离心、悬浮、离心，然后将菌体悬浮于新鲜的MRS液体培养基中，使OD≈1.0待用。

表1 实验用益生菌冲剂信息

MRS固体培养基和猪胆盐购自北京奥博星生物技术有限公司，过氧化氢溶液购自厦门安永博科技有限公司，MRS液体培养基购自杭州百思生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对环境压力条件筛选

借鉴袁琨等[7]实验方法，将OD≈1.0的3种产品的益生菌用胆盐、酸和过氧化氢处理，具体浓度如下，每个处理重复3次。A：胆盐浓度0%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%（w/v）；B：pH值为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和6.5；C：H2O2浓度0%、0.003 3%、0.006 7%、0.010 0%、0.0133%（v/v）；37 ℃恒温培养12 h，测量3种益生菌产品在600 nm的OD值。

1.2.2 环境压力耐受能力测定

借鉴袁琨等[7]实验方法，将OD=0.5～1.0的3种产品培养液按上述方法清洗并悬浮于MRS中，使OD≈1.0，立刻对菌液进行以下4种处理，每个处理重复3次。A：0.3%胆盐作为胆盐压力；B：pH值为2作为酸性压力；C：0.01% H2O2作为氧化压力；D：无压力的对照。菌液在37 ℃培养，在第4 h、8 h、12 h、24 h和48 h测OD。以时间为横坐标，以OD为纵坐标作各压力组和对照组的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 无环境压力下生长情况

由图1知，在无压力环境中，A、C产品益生菌在24 h时菌落达到稳定期并持续到48 h。而B产品益生菌在24 h时正处于稳定期，在48 h时进入衰亡期。

图1 3种益生菌冲剂内所含益生菌在无环境压力下的生长情况

2.2 耐胆盐能力

在12 h内，3种产品对不同胆盐浓度的适应能力都较强，在0.4%胆盐浓度下3种产品都能成功繁殖生长。其中在0.1%胆盐浓度下A、C产品益生菌耐受能力优于无胆盐对照组，在0.4%胆盐浓度下B产品益生菌耐受能力优于无胆盐组（图2）。依据此结果，选取0.3%胆盐浓度用于动态活性研究。

图2 3种益生菌冲剂内所含益生菌在不同胆盐浓度的活性

3种产品在0.3%胆盐浓度下培养48 h的动态活性如图3所示。3种产品在4 h测定时菌落总数已经达到顶峰，往后开始进入衰亡期。与无压力对照组相比可以看出，0.3%浓度胆盐对3种产品的菌株都具有较强的促进生长能力。

图3 胆盐浓度为0.3%时3种益生菌冲剂内所含益生菌的生长情况

2.3 耐酸能力

在pH值为1.5～3.0培养12 h时，3种产品的益生菌均处于抑制状态，而在pH值为3.5时A、C产品益生菌能进行少量繁殖且C产品益生菌比A产品益生菌繁殖稍强，而B产品益生菌仍被抑制，无法繁殖。说明A、C产品益生菌的耐酸能力比B产品好（图4）。依据此结果，选取pH=2.0用于动态活性研究。

图4 3种益生菌产品内所含益生菌在不同pH值下的实验结果

在pH值为2.0下，在培养的48 h内，A、B产品益生菌被全程抑制，C产品益生菌能进行少量繁殖。说明在胃酸强度的pH下（pH=2.0），3种产品益生菌的耐受能力一般（图5）。

图5 pH=2.0时3种益生菌冲剂所含益生菌的生长情况

2.4 抗氧化能力

在H2O2浓度为0.003 3%时培养12 h，对3种产品的益生菌抑制作用不明显，H2O2浓度高于0.006 7%时，3种产品益生菌生长受限。可以说明3种益生菌具有一定的抗氧化能力（图6）。依据此结果，选取0.010 0% H2O2浓度用于动态活性研究。

图6 3种益生菌冲剂所含益生菌在不同H2O2浓度下的生长情况

在0.010 0% H2O2中的动态生长情况如图7所示。3种益生菌冲剂所含益生菌在0.010 0%固定浓度的H2O2中培养48 h，A、B产品的益生菌全程被抑制，无生长。而C产品益生菌在48 h监测时，发现成功繁殖并达到最高菌落浓度。

图7 3种益生菌冲剂所含益生菌在0.010 0% H2O2中的生长情况

3 结论

3种益生菌产品在胆盐浓度为0.1%、0.2%、0.3%和0.4%下均能保持活性，且A和C产品在0.1%的浓度下出现益生菌生长速度超过无压力对照组的情况，说明低浓度胆盐能促进部分益生菌产品的生长繁殖。在pH值低于3.5时，3种产品的益生菌生长活性受限，无法大量繁殖，说明3种益生菌产品耐酸性一般。使用低浓度的H2O2处理后，发现3种益生菌在低浓度的H2O2（0.003 3%）浓度下能进行生长繁殖，可以说明3种益生菌产品都有一定的抗氧化性能。如何提高产品益生菌的耐消化活性，是各个厂家研发人员需要重点解决的问题。对益生菌冲剂产品的探究，能为市场监管部门提供数据支撑，帮助研发人员更好地开发该类产品。