碘化N-正丁基氟哌啶醇通过调控FoxO1减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤

庞海燕，陆兵儿，石刚刚

（汕头大学医学院药理学教研室，广东 汕头 515041）

随着人口老龄化的不断加剧，心血管疾病的发病率和病死率呈现出逐年增高的趋势，成为威胁人类健康的一大类公共卫生疾病。而在心血管疾病的治疗过程中，心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）损伤已经成为不可忽略的问题。心肌I/R损伤是心肌组织在缺血一段时间后恢复血供，非但没有使结构和功能得到完全恢复或明显改善，反而出现比再灌注前更明显、更严重的损伤和功能障碍的现象。临床上表现为严重的和持续性的胸骨后疼痛，伴有血清心肌酶活性升高和进行性心电图改变，可能伴有心律失常、心脏破裂、休克或心力衰竭[1]。许多观点认为I/R损伤与氧自由基爆发、线粒体功能障碍、Ca2+超载、炎症反应以及能量代谢障碍等机制相互关联、协同作用[2]，这些病理生理变化的分子机制成为了动物实验和临床研究的热点。

碘化N-正丁基氟哌啶醇（F2）是由我们实验室在氟哌啶醇的基础上进行哌啶基团的修饰，筛选出的一种新型化合物。F2避免了氟哌啶醇的锥体外系不良反应，保留了扩张冠状动脉的作用，具有很好的应用前景[3]。以往的研究显示，F2对心肌细胞和心脏微血管内皮细胞缺氧复氧损伤具有良好的保护作用，其保护机制可能与拮抗钙超载[4]和减轻氧化应激[5]有关。相关研究表明，F2可增加超氧化物歧化酶活力，降低丙二醛浓度[6]。然而，F2通过何种机制减轻I/R过程中的氧化应激仍不清楚。叉头框蛋白O1（forkhead box protein O1，FoxO1）可通过上调超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等抗氧化基因的表达，减轻氧化应激[7]。基于F2对缺氧复氧诱导的氧化应激损伤的保护作用以及FoxO1的抗氧化应激作用，本研究在整体I/R模型上探讨F2是否通过调控FoxO1来减轻I/R损伤。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物C57BL/6J小鼠，8～12周龄，雄性，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于汕头大学医学院实验动物中心。本研究经汕头大学医学院实验动物伦理委员会审查批准。

1.1.2 主要试剂和仪器戊巴比妥钠购自德国Merck公司；FoxO1兔多克隆抗体购自美国CST公司；GAPDH鼠多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、二氢乙锭荧光探针购自上海碧云天生物技术有限公司。小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司）；Vevo LAZR小动物多模成像系统（加拿大Fujifilm Visual Sonics公司）；TBA-40FR全自动生化分析仪（日本Toshiba公司）；CM1850冰冻切片机（德国Leica公司）；Olympus BX53正置荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌I/R模型的建立及给药8～12周龄的小鼠通过腹腔注射1%的戊巴比妥钠（75 mg/kg）进行麻醉，经气管插管连接呼吸机（呼吸频率115，呼吸比1.3∶1，潮气量2.0）。于小鼠第3和第4肋骨间开胸暴露心脏，撕开心包膜，用8-0的带针缝线结扎左前降支，通过心电图出现ST段抬高证实为缺血。小鼠缺血45 min后去除结扎，关闭肋骨间隙并缝合肌肉和皮肤，进行24 h再灌注。给药：F2于I/R手术前24 h以10 mg/kg的剂量腹腔注射给药；FoxO1的抑制剂AS1842586（AS）于I/R手术前48 h、24 h、30 min分3次以10 mg/kg的剂量腹腔注射给药。

1.2.2 小动物多模成像系统检测心功能小鼠按随机数字表法分为假手术组（sham组）、模型组（I/R组）、I/R+F2组，每组6只。采用3.0%（体积分数）异氟烷气体诱导麻醉小鼠，1.0%（体积分数）异氟烷气体维持麻醉。将小鼠固定在小动物多模成像恒温操作台上，使用脱毛膏将小鼠胸部毛发脱除干净，用MS-400超声探头在胸骨旁短轴切面分别采集M-Mode和B-Mode图像。由图像数据分析可得左心室射血分数和短轴缩短率。

1.2.3 全自动生化分析仪检测血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的活性小鼠按随机数字表法分为假手术组（sham组）、模型组（I/R组）、I/R+F2组，每组6只。将小鼠血清用生理盐水分别稀释64倍和16倍，吸取稀释后的样本100 μL于检测管，用全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶活性。

1.2.4 蛋白质印迹法检测心肌组织中FoxO1蛋白的表达水平小鼠按随机数字表法分为假手术组（sham组）、模型组（I/R组）、I/R+F2组，每组6只。提取小鼠心肌组织蛋白：按100 mg心肌组织加1 mL蛋白裂解液的比例加入预冷的蛋白裂解液，用乳化分散仪进行组织匀浆，冰上静置30 min，4℃13 000 r/min离心15 min，收集上清液以相同条件再次离心后收集上清液。BCA法进行蛋白定量后按4∶1的比例加入5倍上样缓冲液，煮沸5 min变性，冷却后使用细胞超声破碎仪在冰上超声（工作时间3 s，间隔时间5 s，工作次数3次）；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压50 V）至分离胶后，更换100 V电压继续电泳1 h；电转膜法将蛋白转移到硝酸纤维素膜；5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h；使用Bio-Rad化学发光仪曝光；使用Image Lab分析软件分析蛋白条带的灰度值。

1.2.5 二氢乙锭荧光探针法检测心肌组织中活性氧的表达小鼠按随机数字表法分为I/R组、I/R+F2组、I/R+AS组、I/R+AS+F2组，每组6只。取下小鼠心脏制备厚度为8 μm的冰冻切片，将二氢乙锭原液用磷酸盐缓冲液稀释3 000倍，每个切片滴加50 μL稀释后的二氢乙锭，37℃避光孵育30 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5 min，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色5 min，磷酸盐缓冲液冲洗5 min，滴加抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察染色结果。通过分析荧光强度反映活性氧的表达水平。

1.3 统计学分析

应用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量资料经K-S正态性检验符合正态分布，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 F2可改善小鼠心肌I/R后的心功能障碍

与sham组相比，小鼠心肌缺血45 min再灌注24 h后，射血分数和短轴缩短率均降低，差异具有统计学意义（P值均＜0.01）；小鼠I/R手术前给予F2预适应后，射血分数和短轴缩短率均升高（P值均＜0.01），表明I/R导致的心功能障碍得到明显改善，如图1所示。

图1 F2对I/R小鼠心功能障碍的保护作用

2.2 F2可减少小鼠心肌I/R后血清酶的漏出

与sham组相比，小鼠心肌缺血45 min再灌注24 h后，肌酸激酶、肌酸激酶同工酶和乳酸脱氢酶的漏出增多（P值均＜0.01）；I/R手术前给予F2预适应的小鼠肌酸激酶、肌酸激酶同工酶和乳酸脱氢酶的漏出减少（P值均＜0.01），如图2所示。

图2 F2对I/R小鼠血清酶漏出的影响

2.3 F2可提高小鼠心肌组织中FoxO1蛋白的表达

与sham组相比，小鼠心肌缺血45 min再灌注24 h后，心肌组织中FoxO1蛋白水平下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）；给予F2预适应的小鼠心肌组织中FoxO1的表达明显提高（P＜0.01），如图3所示。

图3 F2对小鼠I/R心肌组织中FoxO1蛋白表达的影响

2.4 FoxO1抑制剂拮抗F2对I/R小鼠心肌组织中活性氧的抑制作用

如图4所示，红色荧光强度越强，说明组织中活性氧的含量越高。与模型组（I/R组）相比，F2预处理的I/R小鼠心肌组织中的活性氧含量降低（P＜0.01）；而给予FoxO1的抑制剂AS后，F2对活性氧的抑制作用被拮抗（P＜0.01）。

图4 F2及FoxO1抑制剂对小鼠心肌组织中的活性氧含量的影响

3 讨论

本研究利用整体I/R模型，采用小动物活体多模成像系统检测小鼠心功能，全自动生化分析仪检测小鼠血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的活性，通过射血分数和短轴缩短率以及血清酶漏出评价I/R损伤程度。研究结果表明，小鼠I/R手术前给予F2预适应可以减轻I/R损伤。这与Lu等[8]的研究中，F2对心肌细胞和心脏微血管内皮细胞缺氧复氧损伤发挥保护作用是一致的。

心肌I/R损伤的发生机制很复杂，氧化应激是导致心肌I/R损伤的主要因素之一。氧化应激是活性氧的产生和抗氧化防御系统之间失衡的结果。研究表明，氧化应激的进一步发展可导致心肌重构[9]。减少氧化应激的发生可以减轻I/R诱导的心肌损伤。我们以往的研究发现F2可以减轻缺氧复氧引起的心脏微血管内皮细胞的氧化应激[5]，但F2减轻氧化应激的保护机制尚不清楚。本研究蛋白免疫印迹结果显示，F2可以有效提高心肌I/R过程中FoxO1的表达。Mohseni等[7]研究表明，FoxO1可通过转录激活超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等抗氧化基因的表达，减轻氧化应激。接着对机制的进一步探索，根据不同处理组中的活性氧含量结果分析，我们发现使用FoxO1的抑制剂AS1842586后，F2减轻氧化应激的保护作用被抑制。这表明F2可以通过对FoxO1的调控减轻氧化应激，从而保护心肌I/R损伤。

综上所述，本研究在整体水平上证实了F2对心肌I/R损伤的保护作用，并初步证实F2可以通过调控FoxO1的表达，减轻氧化应激，进而减轻心肌I/R损伤。但关于F2具体通过何种途径调控FoxO1，仍有待研究。在心肌I/R损伤的发病机制和治疗的研究进程中，虽然各种抗氧化治疗已成功应用于临床前研究，但事实上将这种抗氧化治疗融入临床实践还是十分具有挑战性的，其中一个挑战就是动物模型与人类状况的可比性。而面对种种挑战与困难，仍需要学者们付出大量的时间与努力进行研究克服，尽早攻克这威胁人类健康的一大类疾病。