1型糖尿病患者外周血环状RNA差异表达分析

林 锟，吴逸希，曾 琼

（1．汕头大学医学院第一附属医院内分泌代谢科，广东 汕头 515041；2．汕头大学医学院第一附属医院神经内科，广东 汕头 515041）

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是对儿童青少年危害重大的自身免疫性疾病，其发病机制尚未十分清楚，亦缺乏早期血清学标志物[1]。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类特殊非编码RNA分子，其分子属封闭环状结构，表达稳定，不易降解[2]。这使得circRNA在作为新型临床诊断标记物的开发上具有明显优势。这是一种新的、高度敏感的生物标记物，具有很高的价值。研究发现circRNA参与了疾病的发生发展，包括自身免疫性疾病[3]。目前关于T1DM与circRNA的相关性研究较少。本研究假设circRNA通过多种基因表达调控机制影响T1DM的发生发展，在胰岛细胞损伤早期circRNA即出现差异表达，由于circRNA的高度稳定性，异常表达的circRNA可在血液中被检测出并作为未来T1DM一种新的、高度敏感的生物标记物。本研究通过采用circRNA芯片检测T1DM患者和正常人群外周血circRNA表达谱，采用生物信息学方法预测靶微RNA（micro RNA，miRNA），探讨circRNA可能参与的T1DM分子机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2021年7—12月于汕头大学医学院第一附属医院内分泌科住院治疗的T1DM患者3例，均符合T1DM诊断标准。排除标准包括其他类型糖尿病、肝肾功能障碍、急性应激状态、恶性肿瘤、心脑血管疾患和妊娠患者。同时纳入性别、年龄与T1DM患者匹配的健康对照者3名。本研究经汕头大学医学院第一附属医院伦理委员会审核批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 收集临床资料、体格检查并常规进行血脂、空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白、血脂和肝肾功能检测。

1.2.2 基因芯片检测 空腹抽取静脉血5 mL，放入乙二胺四乙酸，抗凝管颠倒混匀后，放于-80℃冰箱储存备用；采用Trizol（美国Invitrogen公司）提取总RNA，其浓度、纯度采用分光光度计测定，样品合格后采用3′→5′核糖核酸外切酶消化线性RNA分子，互补DNA进行扩增、标记（荧光），Agilent TapeStation系统进行杂交、清洗，成像通过Axon基因芯片扫描仪呈现，circRNA差异表达谱采用GenePixPro 6.0软件分析。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测 选择差异倍数较大的circRNA进行实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）检验。总RNA反转录获得cDNA模板后使用qPCR仪（Applied Biosystems 7900）进行扩增，以U6作为内参，circRNA的相对表达水平以计算。引物见表1。

表1 qPCR引物

1.3 统计学处理

使用SPSS 18.0统计学软件分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；非正态分布计量资料以M（Q1，Q3）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

T1DM组患者年龄和性别分别为男14岁，男21岁，女18岁，平均糖化血红蛋白为12.82%。对照组为性别、年龄1∶1匹配入组，糖化血红蛋白均小于6%。

2.2 芯片检测结果

两组患者外周血样本circRNA芯片的筛选，上调共5 134个，下调共5 426个；69个circRNA差异有统计学意义（P＜0.05，|logFC|＞1.5），其中64个上调，5个下调，见图1。

图1 1型糖尿病患者外周血环状RNA差异表达

2.3qPCR验证

选取|log FC|改变更为明显的5个circRNA通过qPCR验证发现，TIDM组与对照组相比hsa_circ_101079、 hsa_circ_100332、 hsa_circ_085129 及hsa_circ_103845表达差异均有统计学意义（P值均＜0.05），hsa_circ_006157在两组间表达差异无统计学意义（P=0.48）。见图2。

图2 qPCR验证差异表达环形RNA

3 讨论

近年来，非编码RNA在表观遗传学的作用越来越受到重视。在所有非编码RNA中，长链非编码RNA和microRNA等早已被人熟知。而circRNA则是全新领域，与人类疾病的发生、发展有着密切的关联，是一种充满前景的分子标志物和治疗靶点。circRNA在各种疾病发病机制中发挥重要作用，包括癌症、动脉粥样硬化、骨关节炎、肺纤维化、肌强直性营养不良和阿尔茨海默病[3]。在糖尿病领域，虽然circRNA的相关研究较少，但已有让人欣喜的收获。Stoll等[4]发现circRNA是细胞活动的新调控因子，在糖尿病发生时参与了β细胞的功能失调。此外，circRNA cdr1as在胰岛细胞功能和胰岛素分泌中起着重要作用[5]。临床研究方面，有研究通过微阵列分析比较了2型糖尿病患者和对照组受试者外周血中circRNA的表达情况，并在较大的独立队列中进行验证，结果提示hsa-circ-0054633是糖尿病前期和2型糖尿病诊断的生物标志物[6]。

目前涉及T1DM的机制研究较欠缺。本研究通过circRNA芯片检测T1DM患者和正常人群外周血circRNA表达谱，共筛选出4个目的circRNA，分别为hsa_circ_101079、hsa_circ_100332、hsa_circ_085129及hsa_circ_103845。qPCR验证结果表明，这4个circRNA可能成为T1DM和健康个体的新生物标志物。本研究入组病例数虽较少，但诊断准确度较高。我们的研究成果与Li等[7]的研究基本一致。和目的circRNA紧密结合的miRNA与正常免疫反应和自身免疫疾病的发病机制有关[8]。例如，hsa_circRNA_100332靶向结合的hsa-miR-892a在从潜伏性结核向活动性结核的炎症转变期间在CD4+T细胞中下调[9]。hsa_circRNA_085129靶向的hsa-miR-145-5p通过抑制炎症因子的分泌改善巨噬细胞的炎症状态[10]，被认为是多发性硬化症的生物标志物[11]。hsa_circRNA_103845靶向的hsa-miR-127-3p属胰岛特异性miRNA，与胰岛素生物合成和分泌密切相关，其能被脂多糖下调，可能参与脂多糖触发的T1DM发展[12]。因此，我们观察到的所有上游circRNA的上调预示着一种促炎症状态，这可能是T1DM病因的基础。本研究预测胰岛特异性miRNA如hsa-miR-493-5p和hsa-miR-127-3p会被抑制，这可能反映了T1DM中胰岛β细胞的破坏状态。

综上所述，T1DM患者外周血hsa_circ_101079、hsa_circ_100332、hsa_circ_085129及hsa_circ_103845表达显著上调，可能通过靶miRNAs调控相关信号通路参与T1DM的发生发展。