苦瓜果实酵母双杂交文库构建及McRPF互作蛋白筛选

郭金菊 史亮亮 王茹芳 曹海顺 谭德龙 赵俊宏 张长远

(广东省农业科学院设施农业研究所，广东 广州 510640)

苦瓜(MomordicacharantiaL.)是重要的岭南特色瓜类蔬菜，主要以膨大中后期绿果为食用器官，药膳兼用，不仅营养丰富，还具有降糖、降脂、抗癌、防衰老等功能[1]，深受广大消费者喜爱，具有较高的经济和社会价值。

苦瓜属于典型的呼吸跃变型果实，商品果采后3～5 d会逐渐变黄、软化甚至腐烂，严重影响其商品品质和货架期，从而造成较大的经济损失[2]。果实的成熟是一个复杂而精密的调控过程，受基因调控、激素调节以及温度、光照等各种因素影响[3-4]。目前人们仍未能完全揭示其调控机制，而对苦瓜果实成熟的调控机制研究更是鲜有报道。

NAC转录因子是植物特有的、数量众多的转录因子家族，参与植物生长发育、胁迫应答、激素调节等多种生物学过程[5]。近年来，有许多关于NAC转录因子调控果实成熟的报道。例如，在番茄果实成熟调控通路中，NOR[6]、SlNAC1[7]和SlNAC4[8]等NAC转录因子是位于乙烯信号上游的调控果实成熟关键因子[9]；番茄nor自然突变体由于NOR基因第3个外显子区域缺失2个连续的碱基导致移码突变，造成NOR蛋白翻译提前终止，最终抑制果实成熟[10]；SlNAC1为果实成熟的负调控因子，依赖乙烯和ABA信号途径影响果实成熟[7]；SlNAC4为果实成熟的正调控因子，SlNAC4基因下调会延迟果实成熟，显著抑制乙烯合成、叶绿素降解以及类胡萝卜素积累[8,11]。但由于NAC转录因子的种类和功能的多样性，其调控果实成熟的分子机制仍有待研究。其中NAC转录因子McRPF为本研究前期筛选到的苦瓜果实成熟关键因子，但对其调控果实成熟的分子机制尚不清楚。利用酵母双杂交等技术筛选McRPF的互作蛋白，对阐明McRPF调控苦瓜果实成熟的分子机制具有重要意义。鉴于此，本研究构建苦瓜果肉组织酵母双杂交cDNA文库，并利用该文库初步筛选到12个可能与McRPF互作的蛋白，以期为进一步研究McRPF调控果实成熟的分子调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 以苦瓜自交系E12201-e1为材料，于2021年3月种植于广东省农业科学院白云试验基地，常规管理，在盛花期对开花当天子房(幼果)进行挂牌标记。采集处于绿熟期(18 days after pollination, DPA)、破色期(20 DPA)、转色期(22 DPA)和完熟期(24 DPA)4个不同成熟阶段的苦瓜果肉组织，液氮速冻，于-80℃冰箱保存备用。

1.1.2 试验试剂 Oligotex mRNA Kits、高纯度质粒大提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Superscript®Double-Stranded cDNA Kit、UltraPureTMPhenol∶Chloroform∶Isoamyl∶Alcohol(25∶24∶1, v/v/v)购自美国Invitrogen公司；Trimmer-2 cDNA normalization kit购自俄罗斯Evrogen公司；FastPfu DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司；Sfi I限制性内切酶购自立陶宛Fermentas公司；质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；DNA Ligation Kit购自日本TOYOBO公司；酵母质粒小量提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；酵母缺陷型培养基购自美国Clontech公司。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取与mRNA分离提纯 取不同成熟期苦瓜果肉组织等量混合，利用Trizol法提取总RNA，使用Oligotex mRNA Kits分离纯化样本mRNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳观察检测目的片段的完整性与片段长度，用于后续的文库构建。

1.2.2 cDNA文库构建 按照Superscript®Double-Stranded cDNA Kit试剂盒说明书，将纯化后的mRNA进行反转录，合成双链cDNA，加5′接头(3个读码框，每个读码框连接一份，共3份)，并进行均一化处理。使用1%浓度的低熔点琼脂糖胶，电泳cDNA产物，切胶回收1 000 bp以上的目的片段。采用同源重组方式，使用All direct重组酶将上述cDNA分别与经酶切处理线性化的pGADT7载体连接，电转化大肠杆菌感受态细胞。取转化后原液10 μL稀释1 000倍后，从中吸取10 μL涂布于LB平板(含氨苄青霉素)，进行库容鉴定。挑取平板上的单克隆，进行PCR扩增，电泳检测cDNA文库片段长度及重组率。库容(colony-forming units, CFU)鉴定公式如下：

库容量(CFU·mL-1)=平板上的克隆数/10 μL×1000倍×1×103μL

(1)

文库总CFU=文库滴度(CFU·mL-1)×文库菌液总体积(mL)

(2)

阳性率计算公式如下：

阳性率=重组成功数量/克隆总数×100%

(3)

将上述步骤验证合格(文库库容量>1×107CFU，平均插入片段>1 200 bp，阳性率>95%)的酵母双杂交文库，采用铺板培养方式，涂布于25 cm的平板，每板涂布3万个左右克隆子，于37℃过夜培养，第2天使用LB培养基洗脱克隆，利用高纯度质粒大提试剂盒抽提质粒。

1.2.3 pGBKT7-McRPF诱饵载体构建 在McRPF基因的cDNA序列两端添加Sfi I的酶切位点设计引物，进行目的片段扩增。将扩增的目的片段和诱饵载体pGBKT7分别利用Sfi I内切酶(Fermentas)进行双酶切，连接后将连接产物转化至大肠杆菌Top10感受态。对转化后的大肠杆菌进行菌落PCR扩增。反应体系为20 μL：Premix Taq 10 μL，20 μmol·L-1McRPF-F和McRPF-R引物各1 μL，ddH2O 8 μL，挑取菌落为模板；反应程序为：98℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min， 30个循环。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，并对菌落进行测序，获得阳性克隆，进行后续试验。设计的引物序列如下：

McRPF-F：5′-A A G G C C A T T A C G G C C A T G G G T C T A C G A G A C A T C G GA-3′McRPF-R：5′-C C G G C C G A G G C G G C C T C A A G C A A C A A A A T A G T C A A A A TG-3′

1.2.4 诱饵蛋白自激活检测 参照MatchmakerTM GAL4 Two-Hybrid System 3 & Libraries(Clontech)试验方法，将表1组合分别转化到AH109酵母感受态细胞中。每个转化用200 μL无菌水悬浮菌体，温和混匀，涂布于二缺培养基(SD/-Leu-Trp)，30℃恒温培养 4 d， 观察生长状况。从pGADT7与pGBKT7-McRPF共转化AH109长出的酵母转化子中，随机挑取6个菌落点板至四缺培养基(SD/-Leu-Trp-His-Ade)，30℃恒温培养4 d，观察其生长状况。

表1 不同重组质粒组合Table 1 Different combinations of recombinant plasmids

1.2.5 McRPF互作蛋白筛选 用含有正确pGBKT7-McRPF诱饵质粒的AH109酵母转化子作为受体菌制备感受态，将pGADT7文库质粒转入其中，按照1∶10、1∶100和1∶1 000分别涂布于SD-Trp-Leu-His+5 mmol·L-13AT平板，30℃恒温培养3～4 d，观察转化结果，记录转化效率。为了消除背景生长菌落的干扰，在培养至第3天时，用无菌绒布对筛库平板进行影印清除后，继续培养7～14 d。至影印清除后继续培养7 d，从筛库平板中挑取长出的阳性克隆单菌落，转接至 SD/-Leu-Trp 培养基继续培养2～3 d。将上述SD/-Leu-Trp培养基上长出的初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至SD/-Leu-Trp + X-α-Gal和SD/-Leu-Trp-His-Ade 培养基上进行HIS3、ADE2和MEL1报告基因检测，30℃恒温培养3～4 d。

将以上阳性克隆菌株分别接入SD/-Leu-Trp液体培养基，振荡培养过夜后抽提酵母质粒，转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行扩增。将含有阳性克隆的Top10转化子转接至LB液体培养扩增后抽提质粒，对质粒进行DNA测序和BLAST比对。

将阳性克隆回转至含有pGBKT7-McRPF诱饵质粒的AH109酵母感受态细胞中，涂布于SD/-Leu-Trp培养基。再将上述SD-TL缺陷型平板上长出的转化子分别用无菌水稀释后点种至SD/-Leu-Trp和 SD/-Leu-Trp-His-Ade+X-α-Gal 培养基，30℃恒温培养3～4 d，进行回转验证。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取与mRNA分离纯化

将处于不同成熟期的苦瓜果肉组织等量混合，提取总RNA。1%琼脂糖凝胶电泳结果(图1-A)表明，RNA主带清晰，完整性好，无降解，可用于cDNA文库构建。使用Oligotex mRNA Kits试剂盒分离纯化样本mRNA。获得mRNA总量为3.2 μg，电泳检测结果(图1-B)显示，mRNA条带清晰，呈1条均匀集中的弥散条带，质量完好，无降解，满足建库需要。

注：A：总RNA电泳图；M为5 kb DNA marker； B：mRNA电泳图。Note: A: The agarose gel electrophoresis of total RNA. M: 5 kb plus DNA marker. B: The agarose gel electrophoresis of mRNA.图1 苦瓜果肉组织RNA电泳图Fig.1 The agarose gel electrophoresis analysis of RNA extracted from bitter gourd flesh tissue

注：M：1 kb plus DNA marker。1～24: PCR产物。Note: M: 1kb plus DNA marker. 1～24: PCR products.图2 cDNA文库插入片段和重组率检测结果Fig.2 Identification of insertion fragment size and recombination rate of cDNA library

2.2 cDNA文库构建与质量鉴定

取10 μL原始电转化菌液稀释1 000倍后，取10 μL涂布于LB平板(含氨苄青霉素)，共长出约250个克隆子，计算得到文库库容量约为1.25×107CFU。为检测文库重组序列的完整性，随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定。由图2可知，插入片段主要分布在800～2 000 bp，且平均长度大于1 200 bp，阳性率为100%，文库质量较高，符合筛库标准。

2.3 诱饵载体构建与自激活检测

以苦瓜果肉组织cDNA为模板，利用高保真酶FastPfu DNA Polymerase扩增McRPF的编码区序列，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，目的条带大小约为500 bp，与预期片段大小一致(图3-A)。将回收后的目的条带与pGBKT7用Sfi I进行酶切，用T4-DNA连接酶连接后转化至大肠杆菌Top10感受态，并进行菌落PCR(图3-B)和测序鉴定，PCR扩增条带与目的条带大小一致，且测序序列与目的扩增序列一致，表明成功构建了pGBKT7-McRPF诱饵载体。

注：A：1～2：McRPF扩增产物；B：1～6：阳性克隆菌落PCR鉴定结果。M：DL5000 DNA marker。Note: 1～2: A: Amplified products of McRPF. B: 1～6: Identification of the positive clones by PCR. M：DL5000 DNA marker.图3 诱饵载体构建与菌落PCR鉴定Fig.3 Construction and identification of bait recombinant vector

将pGADT7/pGBKT7-McRPF、pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53(阳性对照)、pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC(阴性对照)分别转化AH109酵母感受态细胞，涂布于SD/-Leu-Trp平板培养基上，30℃恒温培养3～4 d。长出的酵母转化子中，随机挑取6个菌落接种至SD/-Leu-Trp-His-Ade培养基。结果显示，3组菌株在SD/-Leu-Trp平板培养基上均能正常生长，仅有阳性对照可在SD/-Leu-Trp-His-Ade培养基上生长(图4)，说明该诱饵蛋白无自激活活性，可进行筛库试验。

图4 诱饵载体pGBKT7-McRPF的自激活检测Fig.4 Self-activation detection of the bait vector pGBKT7-McRPF

2.4 McRPF互作蛋白筛选

将文库质粒转入含有诱饵质粒的感受态中，按3种浓度稀释，涂布平板，分别获得712、94和14个克隆，文库转化效率为1.62×104μg-1(图5-A)。挑取阳性克隆单菌落分别接种至SD/-Leu-Trp+X-α-Gal和SD/-Leu-Trp-His-Ade缺陷平板上，共获得29个初始阳性克隆，且均能同时激活HIS3、ADE2和MEL1报告基因(图5-B)。将筛选到的29个阳性克隆进行DNA测序，并与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析，初步获得13个不同的蛋白编码基因(表2)。将这13种阳性克隆与McRPF诱饵克隆共转化酵母细胞进行回转验证检测，结果显示有12个阳性克隆能激活HIS3、ADE2和MEL1报告基因(图5-C)。

注：A：文库转化效率鉴定；B：文库筛选获得的阳性克隆，其中“+”为阳性对照，“-”为阴性对照；C: 候选互作蛋白的回转验证。Note: A: Library transformation efficiency identification. B: Positive clones obtained by library screening, ‘+’ is the positive control, ‘-’ is the negative control. C: Retest of candidate interacting proteins.图5 cDNA文库筛选结果Fig.5 Results of cDNA libary screening

表2 McRPF互作蛋白比对结果Table 2 Blast results of McRPF interacting proteins

3 讨论

酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的一种便捷、有效的方法，而高质量cDNA文库的构建是利用酵母双杂交系统筛选互作蛋白的重要前提[12-13]。随着分子生物学研究的不断深入，目前已经获得了很多物种的酵母双杂交cDNA文库，并在此基础上筛选获得目标蛋白的互作蛋白[14-18]。苦瓜为岭南特色瓜类蔬菜作物，基础研究起步较晚，截至目前鲜有关于苦瓜酵母双杂交文库的相关报道。本研究利用All-Direct技术，通过同源重组方法建立了苦瓜不同成熟期果肉组织cDNA文库，文库库容为1.25×107CFU，插入片段平均长度大于1 200 bp，阳性率为100%。评价cDNA文库质量的关键指标主要是文库库容、空载率和插入片段平均长度[10,14]。本研究构建的文库质量达到了酵母筛选文库标准，为进一步开展互作蛋白筛选和新基因的挖掘工作奠定了基础。

果实成熟是高度协调、复杂的生物学过程，受自身基因和外界环境条件等各种因素影响，涉及色泽、质地等外部形态变化，以及细胞壁降解、糖类、有机酸和芳香化合物代谢等内在生理生化变化[3-4]。近年来，通过对番茄、拟南芥和水稻等模式植物的研究发现，转录调控在果实成熟过程中发挥着重要作用，并相继从番茄[19]、猕猴[20]、香蕉[21]等果实中分离鉴定出EIN3/EIL、AP2/ERF、MADS-box、NAC、WRKY等许多与果实成熟相关的转录因子。本研究利用构建的酵母双杂交文库，对苦瓜果实成熟关键因子McRPF的互作蛋白进行筛选，初步筛选获得13个可能与McRPF互作的蛋白，并通过回转验证最终获得12个候选靶标蛋白。通过基因功能注释和相关文献报道，发现12个候选靶标蛋白涉及多种生物学过程，例如，WRKY31可能参与各种生物和非生物胁迫应答[22]、糖代谢[23]、果实的成熟衰老[21,24]等；蛋白酶Do-like 1(Protease Do-like 1，DEG1)参与光系统Ⅱ(Photosystem Ⅱ，PSⅡ)复合物反应中心D1蛋白的降解，从而在PSⅡ复合物的修复循环和功能维护中发挥重要作用[25]；异黄酮还原酶(isoflavone reductase, IFR)是异黄酮分解途径的关键酶之一，在调控异黄酮含量及成分方面发挥着重要作用[26]；泛素NEDD8-like蛋白Rub1是最重要的类泛素化蛋白之一，被鉴定为细胞氧化还原稳态的关键调节因子[27]；精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase, ADC)是多胺合成途径中的关键酶，能通过调节活性氧的积累增强植物的对逆境胁迫的耐受能力[28-30]。E3泛素连接酶RGLG2(E3 ubiquitin-protein ligase RGLG2)是蛋白质泛素化反应的关键酶，广泛参与植物生长发育、胁迫响应和信号转导等生命活动，如拟南芥RGLG1和RGLG2与AtERF53相互作用负调控拟南芥的旱胁迫响应[31-33]。由此推测MCRPF通过与WRKY31互作调控苦瓜果实的成熟，为进一步揭示McRPF调控苦瓜果实成熟的分子机制奠定了基础。

4 结论

本研究构建了不同成熟期苦瓜果肉组织酵母双杂交文库，该文库库容为1.25×107CFU，平均插入片段大于1 200 bp，阳性率为100%，文库质量较高，为果实成熟相关基因筛选提供了资源。此外，利用该文库筛选获得12个与苦瓜果实成熟关键调控蛋白McRPF互作的蛋白，比对结果发现12个候选靶标蛋白涉及光系统修复、异黄酮分解、植物生长发育和胁迫响应等多种生物学过程，为深入解析McRPF调控苦瓜果实成熟的分子机制奠定了基础。