银杏内酯B 对人结肠癌SW480 细胞恶性生物学行为及ROS/XIAP 信号通路的影响*

孙小虎，于 洪，王 璐，艾福录，白静慧

（中国医科大学肿瘤医院·辽宁省肿瘤医院，辽宁 沈阳 110042）

结直肠癌是全球第四大与癌症相关的死亡原因［1］，化学药物治疗（简称化疗）常用于治疗直肠癌，但化疗副作用大，且癌细胞会产生耐药性［2］。有研究表明，银杏内酯B 对癌前病变、原位癌、浸润癌、转移及向远端播散阶段均显示出预防或治疗作用［3-4］，且可抑制癌细胞的生长［5］。活性氧（ROS）可调节细胞生长、增殖、迁移，并可通过Thr308 磷酸化激活［6-7］。X 连锁凋亡蛋白抑制剂（XIAP）属凋亡抑制剂家族成员，位于细胞质中，可作为细胞凋亡的有效调节剂。XIAP 通过抑制半胱氨酸蛋白酶（caspase）- 3、caspase - 7 和caspase - 9 活性而发挥抗凋亡作用，且在癌症化学耐药性中起关键作用［8］。此外，ROS 活化可增强XIAP蛋白酶体表达从而促进癌细胞生长及增殖。本研究中探讨了银杏内酯B 对人结肠癌SW480 细胞恶性生物学行为及ROS / XIAP 信号通路的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：Multiskan MK3 型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；Transwell 腔室（孔径8 mm，日本Costar公司，批号为56324132）；VC - 4785 型显微镜（日本Olympus 公司）；FACSCalibur™型流式细胞仪（日本Sysmex公司）；AB7300型热循环仪（美国ABI公司）；DY‑CZ-20H 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；723型紫外- 可见分光光度计（上海沪粤明科学仪器有限公司）。

试药：RPMI-1640 培养基（批号为202036269），胎牛血清（FBS，批号为23654.69），1%青霉素/ 链霉素（批号为41563.36），均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；紫杉醇（批号为2148.68，含量99.5%），纤维素膜（批号为BV - 41526563.3），均购自美国Sigma 公司；银杏内酯B（批号为NM-36547，含量99.5%），SDS（批号为5256363.3），均购自美国Thermo Fisher Scien‑tific 公司；四唑盐（MTT，美国BioInnovatise 公司，批号为VB - 41563.36）；基质胶Matrigel（美国BD Biosciences公司，批号为VC-152696.63）；二甲基亚砜（DMSO，批号为BC-41521.3），膜联蛋白V-EGFP 细胞凋亡检测试剂盒（批号为SD - 236548.3），荧光染料DCFH -DA（批号为741589），均购自上海碧云天生物技术有限公司；Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司，批号为BV -44588.36）；HiScript Ⅱ试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号为DS - 47152.36）；All - in - One™mRNA qRT-PCR 检测试剂盒（美国GeneCopoeia 公司，批号为521680）；蛋白酶抑制剂混合物（美国Calbiochem公司，批号为XC - 4152336）；BCA 试剂盒（德国Pierce公司，批号为415236.36）；anti - XIAP 一抗（1︰1 000，批号为BH54263），GAPDH 一抗（1︰1 000，批号为BT48763），免疫球蛋白G 的山羊抗兔二抗（批号为SX-47152.36），均购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司；ECL 化学发光试剂盒（美国CST 公司，批号为BD -47125.36），ROS 检测试剂盒（合肥莱尔生物科技有限公司，批号为LE-2130651）。

细胞：人结肠癌SW480 细胞（美国典型培养物保藏中心）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组

取SW480 细胞适量，接种于含10%FBS 和1%青霉素/ 链霉素的RPMI - 1640 培养基中，在37 ℃、5%CO2条件下培养。实验分为模型组（培养基+SW480 细胞）、紫杉醇组（5 mg/L+培养基+SW480 细胞）［9］，以及银杏内酯B 低、高剂量组（50，100 μmol/ L + 培养基+SW480细胞）［10］，各组均培养72 h，每孔设6个平行样。

1.2.2 观察指标及检测方法

细胞存活率：采用MTT 法。取1.2.1 项下对数生长期细胞适量，以1 × 104个/ 孔的初始密度接种于平底96 孔细胞培养板中，培养48 h。每孔加入MTT，37 ℃、5%CO2条件下孵育4 h，除去培养基，加入DMSO，室温放置30 min，以酶标仪、于490 nm 波长处测定吸光度（OD），以蒸馏水为空白对照。存活率（%）=（OD用药组-OD模型组）/（OD用药组-OD空白对照）×100%。

细胞凋亡率：采用流式细胞术。取1.2.1 项下对数生长期细胞适量，以1.25 × 105mL-1的初始密度接种于6 孔板中，在37 ℃、5%CO2条件下培养72 h。用PBS洗涤，以初始的密度重悬于1×Annexin V结合缓冲液中。将100 μL 细胞悬液与5 μL 膜联蛋白（V - FITC）和5 μL碘化丙啶（PI）在黑暗中于室温下孵育15 min。孵育结束后添加400 μL 1×结合缓冲液后，采用流式细胞仪分析样品。凋亡率（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

侵袭迁移水平：采用Transwell 法。取1.2.1 项下对数生长期细胞适量，以2×104个/孔的初始密度接种于200 μL 无血清培养基中，后移至上腔室，并于底部腔室中加入含10%FBS 的培养基。上腔室涂有或不涂有Matrigel 用于入侵或迁移水平测定。在37 ℃、5%CO2条件下培养细胞48 h，后以棉签除去顶部小室中的细胞，并用甲醇固定下表面细胞，用0.1%结晶紫染色，显微镜下观察并拍照。

ROS 水平：采用荧光探针法。取样品、标准品和DCFH - DA 标记的检测抗体，依次添加到捕获抗体的包埋微孔中，温育并彻底洗涤后，用四甲基联苯胺着色液进行显色反应，用光度计在492 nm 波长处测定OD，根据标准品的浓度和每个孔的OD绘制标准曲线。

XIAP mRNA 表达水平：采用反转录聚合酶链反应法。取1.2.1项下对数生长期细胞适量，以Trizol法提取总RNA，反转录合成cDNA，以GAPDH 为内参。XIAP、GAPDH 引物由上海Sangon Biotech 公司合成，序列如下，XIAP 正向，5' - CGTAGCTAGCTAGTAGTCGATC‑GATCGTAGCTAGCTAGCTAGC - 3'；反向，5' - CG‑TAGCTAGTCAGTCGATCGATCGATGCTAGCTAGCTAG‑TCGTG - 3'。GAPDH 正向，5' - CGTAGCTAGCTAGTC‑GATCGTAGCTAGCTGACTGTGATCG - 3'；反向，5' -CGTAGCTAGCTAGTCGATCGTAGCTAGCTGATCGATC‑GC - 3'。PCR 总反应体系（10 μL）为，SYBR Premix Ex Taq 4 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，去离子水4 μL。反应程序为，96 ℃10 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃10 s，40 个循环。读取循环阈值（Ct值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 的表达量。每组平行实验3次。

XIAP蛋白表达水平：采用Westernblot法。取1.2.1项下对数生长期细胞适量，加入1 mL RIPA 蛋白裂解液，以BCA 法测定XIAP 蛋白含量。10% SDS - PAGE 电泳后电转，4 ℃下与一抗孵育过夜，弃一抗；室温下与免疫球蛋白G 的山羊抗兔二抗孵育1 h。加入ECL 化学发光试剂，将PVDF 膜放入暗盒中，压上X 胶片，取出胶片后显影、定影、清洗。以Image J软件将条带灰度值数字化，目的条带与内参条带灰度比值为各目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 24.0 统计学软件分析。计量资料以±s表示，两两比较行SNK -q检验，多组间比较行单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞存活率

与模型组比较，紫杉醇组及银杏内酯B 低、高剂量组细胞存活率显著降低（P<0.05）。详见表1。

2.2 细胞凋亡率

与模型组比较，紫杉醇组及银杏内酯B 低、高剂量组细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。详见表1及图1。

2.3 细胞侵袭迁移水平

与模型组比较，各用药组细胞穿膜数显著减少（P<0.05）。详见表1。

2.4 各组细胞ROS 水平

与模型组比较，紫杉醇组与银杏内酯B 低、高剂量组细胞ROS水平显著降低（P<0.05）。详见表1。

2.5 细胞XIAP mRNA 及蛋白表达水平

与模型组比较，紫杉醇组与银杏内酯B 低、高剂量组细胞XIAP mRNA 及蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。详见表1。

表1 各组观察指标比较（±s，n=6）Tab.1 Comparison of observed indexes in each group（±s，n=6）

表1 各组观察指标比较（±s，n=6）Tab.1 Comparison of observed indexes in each group（±s，n=6）

注：与模型组比较，*P < 0.05。Note：Compared with those in the model group，*P < 0.05.

组别模型组紫杉醇组银杏内酯B低剂量组银杏内酯B高剂量组剂量0 5 mg/L 50 μmol/L 100 μmol/L存活率（%）85.52±5.16 29.26±3.18*55.15±2.36*38.45±2.41*凋亡率（%）4.27±0.53 15.14±0.53*8.63±0.55*13.25±0.56*穿膜数（个）626.96±32.69 128.26±29.54*418.96±31.62*198.54±30.29*ROS（ng/μL）504.27±35.53 115.14±26.53*418.63±30.55*213.25±27.56*XIAP mRNA 5.93±0.36 1.99±0.23*4.49±0.29*2.98±0.31*XIAP蛋白1.41±0.31 0.39±0.35*1.09±0.33*0.66±0.34*

3 讨论

结直肠癌发现时常表现为肿瘤转移，术后易局部浸润和肿瘤复发。银杏内酯B 属内酯类生物碱，可通过减弱肝癌细胞中p38 信号通路的活性来阻止细胞的增殖和侵袭［11］，也可通过肺癌细胞中Akt 途径的失活而抑制细胞增殖并诱导其凋亡［12］。本研究结果显示，50 μmol/ L 和100 μmol/L 的银杏内酯B 可显著抑制SW480细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡。

本研究中，与模型组比较，紫杉醇组及银杏内酯B低、高剂量组细胞ROS、XIAP mRNA 和蛋白表达水平均显著降低，与已有文献结论一致［13］。生物信息学预测分析认为，XIAP 是基于序列互补的ROS 可能的靶标［14］。ROS 在各种癌症中异常表达，并促进了乳腺癌、前列腺癌、肺癌的发生与发展，溴结构域和植物同源结构域的手指转录因子可作为核因子κB（NF - κB）途径的转录调节因子，并增强肺癌细胞中ROS 的转录，最终导致预后不良［15］。另一项关于三阴性乳腺癌的研究表明，ROS表达上调是因为着丝粒蛋白U（有丝分裂必要的着丝粒成分）抑制了泛素化和蛋白酶体降解，此外，间质相互作用分子1（STIM1）可能通过增强ROS的表达和升高前列腺素E2的水平来促进结肠癌细胞的迁移，而短发夹RNA 消耗STIM1 则抑制了结直肠癌细胞的迁移［16］。XIAP是位于ROS启动子区域的反义蛋白，XIAP 被认为是通过隔离其抑制剂，p50 同源二聚体和螯合剂来激活NF - κB 信 号 传导。这又 将NF - κB 亚基p65 募集到XIAP 启动子并增强了XIAP 转录。有研究表明，XIAP 与ROS mRNA 的表达高度相关，而XIAP 的异常表达可调节人巨噬细胞对脂多糖刺激及恶性造血的分化，XIAP 也可通过前列腺素的生物合成促进肿瘤发生［17］，其在人肺癌细胞中高表达，并多与预后不良相关［18］。临床研究表明，miR - 451 抑制了肝癌细胞的增殖，其上调抑制了XIAP 表达，并且XIAP 还可激活Wnt 通路。同时，转录共激活子YAP 可通过与XIAP 启动子中的TEAD 结合位点相互作用，增强XIAP mRNA的表达，从而介导癌细胞耐药性［19-20］。

A.模型组 B.紫杉醇组 C.银杏内酯B低剂量组 D.银杏内酯B高剂量组图1 流式细胞图A.Model group B.Paclitaxel group C.Ginkgolide B low-dose group D.Ginkgolide B high-dose groupFig.1 Flow cytometry

综上所述，银杏内酯B 可有效抑制SW480 细胞的迁移和侵袭并诱导其凋亡，其机制可能与抑制ROS/XIAP信号通路的激活有关。