长链非编码RNA-ROR在骨肉瘤组织中表达及对预后的影响

万全会，徐晓宁，王刘玉，李刚

作者单位：1南阳市第二人民医院骨科，河南 南阳 473000；2郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南 郑州 450001

骨肉瘤恶性程度高、侵袭力强、易发生早期转移，有约30%的病人确诊时已存在肺组织转移［1］，尽管新的辅助治疗手段不断提高，但晚期及发生转移病人5 年生存率依然较低［2］。尽管目前对骨肉瘤病因、发病机制及诊疗等方面有所了解，但影响骨肉瘤发生及进展的关键性基因尚不清楚，为该病临床分子诊断及靶向药物治疗带来了困难。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，Ln‑cRNA）作为机体内普遍存在的一种长度>200 nt 的无编码蛋白功能的RNA，在诸多疾病病理过程中发挥重要作用［3］，尤其是参与了多种癌种的病程进程，参与调控了癌细胞增殖、凋亡、转移、侵袭等过程［4］。IncRNA-重编程调节器（LncRNA-regulator of repro‑gramming，LncRNA-ROR）是一种重要的LncRNA，在细胞重编程过程中发挥重要的调控作用［5］，有研究指出，慢性盆腔炎病人血清中LncRNA-ROR 水平升高［6］。亦有研究指出，LncRNA-ROR 表达水平与心力衰竭严重程度相关［7］。近年来研究发现，其在乳腺癌［8］、前列腺癌［9］、卵巢癌［10］等多种恶性肿瘤组织中表达异常。但其是否参与了骨肉瘤进程，鲜有报道。本研究分析了LncRNA-ROR 在骨肉瘤组织中表达情况，比较了不同骨肉瘤临床病理指标该基因表达差异，探讨其对病人预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取南阳市第二人民医院2008 年2 月至2014 年5 月行手术切除的原发性骨肉瘤病人，纳入标准：①病人入院前未行放化疗；②经临床、影像学及术后病理学检查确诊为原发性骨肉瘤。排除标准：①同时患有其他恶性肿瘤或者其他良恶性肿瘤继发骨肉瘤者；②有代谢性骨病病史，心肝肾等重要脏器严重功能障碍者；③不能完成随访或随访资料不全者。共纳入96 例，男性58 例，女性38 例，年龄范围7～64 岁，中位年龄21 岁。肿瘤位置：股骨42 例，胫骨19 例，其他35 例。按照En‑neking 分期标准：ⅡA 期33 例，ⅡB 期43 例，Ⅲ期20例。组织学分型：成骨细胞型45 例，软骨细胞型15例，成纤维细胞型18 例，混合型18 例。同期，留取行手术治疗的非肿瘤病人新鲜正常骨组织45例，中位年龄23 岁，与骨肉瘤病人差异无统计学意义（Z=1.75，P=0.079）。

本研究病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1采用实时荧光定量PCR术分析骨肉瘤和正常骨组织中LncRNA-ROR 表达水平 取液氮中保存的骨肉瘤及正常骨组织，剪碎，冰浴中研磨充分，按Trizol 试剂盒（美国Invitrogen 公司，批号15596-026）说明对组织中总RNA进行提取，重复进行3次，利用核酸蛋白定量仪（美国Invitrogen 公司，型号Qubit 3.0）分别对260 nm 和280 nm 处吸光度OD 值进行测定，OD260/OD280 在1.70～2.10 为合格。将总RNA按反转录试剂盒（美国Fermentas，批号K1622）操作说明反转录成cDNA。按照应该定量PCR试剂盒（日本TaKaRa公司，批号AK5805）说明利用实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司，型号StepOnePlus）对引物（由上海生工生物公司设计合成）扩增。引物序列：LncRNA-ROR：正 向 5’-GAGGGGACATTTTC‑CATCCT-3’，反向5’-TCCAGTGGCTGTGCTAGATG-3’；GAPDH：正 向5’-AATGGACAACTGGTCGTG‑GAC-3’，反向5’-CCCTCCAGGGGATCTGTTTG-3’。反应条件：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，59 ℃、30 s，74 ℃、30 s，循环38 次，独立重复实验6 次。用2-ΔΔCt法计算骨肉瘤和正常骨组织中LncRNA-ROR表达量。

1.2.2病例随访 所有病人均在术后第1天开始随访，对病人进行电话随访、门诊随诊等，截至2019年5 月31 日，随访时间范围7～60 个月，记录病人生存时间，获得病人5年生存率。

1.3 统计学方法使用SPSS 21.0 统计软件分析。计量资料以±s表示，两组间比较行t检验，多组间比较行单因素方差分析，生存分析使用Kaplan-Meier法，病人预后生存时间影响因素分析采用Cox 回归模型。P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA-ROR 在骨肉瘤和正常骨组织中表达水平LncRNA-ROR 在骨肉瘤组织中表达量为（2.31±0.20），正常骨组织中则为（1.03±0.11），差异有统计学意义（t=39.94，P<0.001）。

2.2 LncRNA-ROR 在不同临床特征指标的骨肉瘤组织中表达差异LncRNA-ROR在不同年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小、组织学分型及是否发生病理性骨折间的表达量差异无统计学意义（P>0.05），而在不同Enneking 分期、KPS 评分及是否发生远处转移间的表达量差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 LncRNA-ROR在不同临床特征指标的骨肉瘤组织中表达差异/±s

表1 LncRNA-ROR在不同临床特征指标的骨肉瘤组织中表达差异/±s

注：LncRNA-ROR为长链非编码-重编程调节器，KPS为Karnofsky功能状态。

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2.3 LncRNA-ROR 在骨肉瘤组织中表达水平对病人5年生存率的影响以LncRNA-ROR 在骨肉瘤组织中表达量的P25值（2.16）为界值，将病人分为低表达组（n=26）和高表达组（n=70），Kaplan-Meier 生存分析结果显示，低表达组病人中位生存时间51.00个月，生存时间（45.42±3.26）个月，5 年生存率50.00%；高表达组病人中位生存时间21.00 个月，生存时间（27.31±2.04）个月，5 年生存率18.57%，Log-Rank检验差异有统计学意义（χ2=13.20，P<0.001）。

2.4 影响骨肉瘤病人5 年生存率的多因素分析以临床指标及LncRNA-ROR 表达量为自变量，以病人生存状态为因变量，行Cox 回归分析，结果显示，Enneking 分期、远处转移和LncRNA-ROR 表达是影响骨肉瘤病人5 年生存率的独立风险因素（HR=2.15、2.83、2.09，P<0.05），见表2。

表2 影响骨肉瘤病人5年生存率的多因素分析

3 讨论

骨肉瘤作为一种恶性肿瘤极高的来源于间叶组织的肿瘤，具有较高的侵袭转移潜力，已成为儿童及青年人群第二大癌症相关死亡原因［11］。近年来，随诊技术进步，在治疗骨瘤方面新的化疗药物及技术方案的不断涌现，在改善病人生命质量及降低肺转移率方面发挥一定作用［12］，但病人总体预后依然不尽如人意，超过1/3 的病人最终死于该病［13］。研究表明，骨肉瘤发生、进展是一个涉及众多基因及信号通路累积突变的综合作用的结果［14-15］。Ln‑cRNA 作为广泛存在于胞浆及胞核内的不具有编码蛋白功能的RNA 分子，不仅参与了多种疾病的发生，而且越来越多的研究开始关注其在癌症病程中的作用［16-17］。LncRNA-ROR 是一种LncRNA 类型，在诱导多能性干细胞形成及维持干细胞多分化潜能中发挥重要作用，同时参与了机体氧化应激过程［5］。研究表明，LncRNA-ROR 高表达参与了肿瘤恶性增殖及细胞侵袭过程，并且可促进上皮-间质转化过程［18］。本研究结果显示，LncRNA-ROR 在骨肉瘤组织中表达量高于正常骨组织，说明LncRNA-ROR 在骨肉瘤组织中表达升高，可能参与了骨肉瘤发生过程。本研究结果显示，LncRNA-ROR 在Enneking 分期ⅡB～Ⅲ期、KPS 评分<70 及发生远处转移的骨肉瘤组织中呈高表达，说明LncRNA-ROR 表达量升高可能参与了骨肉瘤恶性进展，且与骨肉瘤远处侵袭转移有关，可能是骨肉瘤诊疗的潜在目标靶基因。

Shi 等［19］指出，LncRNA-ROR 促进肾癌增殖，且与良好预后呈负相关。Lu等［20］采用荟萃分析的方法评估lncRNA-ROR 在人类癌症预后中的意义，结果显示，高lncRNA ROR表达与较短的总生存期显著相关，与癌症预后较差有关，可以作为各种癌症中不利的预后因素。本研究结果显示，低表达组病人中位生存时间、平均生存时间和5 年生存率50.00%均高于高表达组，说明LncRNA-ROR 表达与骨肉瘤病人预后有关，高表达预示病人预后不良。Cox回归分析显示，Enneking分期、远处转移和LncRNA-ROR表达是影响骨肉瘤病人5年生存率的独立风险因素，进一步说明LncRNA-ROR高表达是骨肉瘤病人不良预后的独立风险因素，可作为评估病人预后的指标。

综上所述，LncRNA-ROR 在骨肉瘤组织中呈高表达，参与了骨肉瘤发生及恶性化进展，且与不良预后有关，是病人生存时间的独立影响因素，有望为骨肉瘤早期诊断及靶向治疗提供新的基因靶位，但LncRNA-ROR 可能的作用机制，尚待进一步利用分子生物学技术予以研究明确。