止麻消痰活血汤对老年心肌梗死大鼠神经调节蛋白-1/受体酪氨酸蛋白激酶erbB3通路及心室重构的影响

王蕊

作者单位：枣庄市中医医院内科，山东 枣庄 277000

心肌梗死（MI）是临床常见的心血管疾病，起病急，病情进展快，由冠状动脉堵塞引起，救治稍有延误，即可造成病人死亡，且大多病人会因心室重构等后遗症而发展为心力衰竭［1-2］。心梗后心肌组织持续的缺血缺氧及救治时的血流再灌注，均可能诱导严重的炎症及氧化应激反应，造成心肌损伤及纤维化，进而导致心室重构，阻止炎症及氧化应激发生发展是抑制心室重构，进而改善MI病人预后的关键［3-4］。神经调节蛋白-1（NRG-1）在心肌发育及心功能维持中具有重要作用，可通过激活受体酪氨酸蛋白激酶erbB3（ErbB3）信号抑制促炎因子表达，降低氧化应激及炎症水平，缓解MI 导致的心肌肥大，延缓心肌纤维化及病理损伤，改善心室重塑，由此可知NRG-1/ErbB3 信号是MI 后心室重构的重要治疗靶点［5-7］。MI 在中医中属于胸痹心痛，病机为“阳微阴弦”，导致气滞、血瘀、痰凝，并上乘于心，以具有消痹、化痰、活血功效的中药方剂可减轻心肌损伤，改善MI 病人临床症状［8-9］。止麻消痰活血汤为著名中医药专家邢月朋自拟方，可治疗动脉粥样硬化，减轻肢体麻木，黄芪为方中主药，可益气并助力血运，改善MI 后心室功能，半夏、胆南星、赤芍、桃仁、甘草等为辅助，能化浊理气，祛痰化瘀，活血通脉，共奏益气、化痰、通脉之功［10-11］，但止麻消痰活血汤是否可调控NRG-1/ErbB3通路，影响老年MI大鼠心室重构，目前尚未有详细研究阐述。2019 年2—10月进行本研究，本研究通过构建老年MI 大鼠模型，对上述问题进行探寻研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 SD 大鼠［上海邦耀生物公司，许可证号SCXK（沪）-2014-0002］，76 只，SPF 级，21 月龄，雄性，体质量450～500 g。在本院动物房中饲养，室内环境达到清洁级，并且安静、通风良好，12 h/12 h 交替光照，温度为25 ℃左右，相对湿度为50%左右，大鼠自由饮食、饮水。

1.1.2试剂与仪器 止麻消痰活血汤（地龙、赤芍、当归、黄芪、川芎、鸡血藤、桃仁、红花、清半夏、丹参、乌梢蛇、胆南星、全虫、陈皮、甘草）购自北京同仁堂；地尔硫䓬（天津田边制药有限公司，批号1701091）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（G1120）购自北京索莱宝科技有限公司；马松（Mosson）染色试剂盒（ZY-4422-1）购自上海泽叶生物科技有限公司；放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解液（高强度）（货号W062-1-1）、大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附测定（ELASA）试剂盒（A0119）、大鼠转化生长因子-β1（TGF-β1）ELISA试剂盒（A0134）、标准二喹啉甲酸（BCA）法总蛋白定量测定试剂盒（货号A045-4-2）、大鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（A0107）购自南京建成生物工程研究所；兔源抗大鼠p-ErbB3 一抗（ab101407）、兔源抗大鼠NRG1 一抗（ab32375）兔源抗 大 鼠ErbB3 一 抗（ab32121）、羊 抗 兔 二 抗（ab150077）、兔源抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗（ab181602）购自美国Abcam 公司等。光学显微镜（DM500），德国Leica公司；多功能酶标仪（Varioskan LUX），赛默飞世尔科技有限公司；电子天平（YP2002），北京佳源兴业科技有限公司；小型蛋白垂直电泳转印系统（1658033），美国Bio-Rad公司；低温高速离心机（Microfuge 20R），美国贝克曼库尔特有限公司；全自动化学发光凝胶成像分析系统（OI-X6），广州光仪生物科技有限公司等。

1.2 方法

1.2.1制备大鼠MI 模型及分组给药 参照文献［12］中方法制备大鼠MI模型如下：取出SD 大鼠，于其腹腔内注射40 mg/kg剂量的2%戊巴比妥钠溶液，待其进入深度麻醉状态时，仰卧固定在手术台，进行气管插管并连接小动物呼吸机做大鼠心电图监测，切口大鼠第3、4肋骨之间距离胸骨左缘约0.5 cm处，开胸暴露心脏并找到大鼠左冠状动脉降支，游离后于其根部约1 mm 处穿线结扎，当大鼠心脏左室颜色变白，同时心电图显示ST 波抬高，即预示模型建立成功，解开去除结扎线后缝合，消毒并将其随机分成五组（每组12只）：模型组、止麻消痰活血汤低剂量组、止麻消痰活血汤中剂量组、止麻消痰活血汤高剂量组、地尔硫䓬组，另选取SD大鼠12只，开胸游离其左冠状动脉降支后仅穿线不做结扎，做假手术组。

将止麻消痰活血汤1剂（地龙10 g、赤芍10 g、当归10 g、黄芪20 g、川芎10 g、鸡血藤15 g、桃仁10 g、红花10 g、清半夏10 g、丹参10 g、乌梢蛇6 g、胆南星10 g、全虫6 g、陈皮10 g、甘草6 g）水煎，过滤后得到药液300 mL，分为10 mL 一份，止麻消痰活血汤低、中、高剂量组分别以10 mL/kg、20 mL/kg、30 mL/kg的剂量灌胃［11］，以生理盐水溶解地尔硫䓬，制备［13］为0.261 mg/mL 的溶液，地尔硫䓬组灌胃10 mL/kg剂量的0.261 mg/mL 地尔硫䓬溶液，模型组和对照组大鼠灌胃10 mL/kg 的生理盐水，各组大鼠都每天给药1次，持续给药28 d。

1.2.2测定大鼠左心室质量指数及收集标本 将给药完全结束后24 h 的大鼠麻醉后测量其体质量（记为G），取腹主动脉血1.6 mL，收集4 ℃离心后的上清液，作为血清存在-80 ℃备用；断头处死后解剖分离出大鼠心脏，取下左心室测量其质量（记为G1），计算左心室质量指数=G1/G×10 000%；然后剪下约0.5 g左心室心肌组织，剪碎加入蛋白裂解液混匀，采用匀浆机上下研磨匀浆，然后收集4 ℃离心20 min后的上清液，得到各组蛋白样品液存在-80 ℃备用；剩余左心室心肌组织进行常规固定、透明、脱水、包埋、切片后，获得厚约4µm的常规病理切片以备后用。

1.2.3HE 与Mosson 染色 将“1.2.2”中的病理切片，选取其中完好、厚薄均匀的进行脱蜡处理后，以100%～70%梯度酒精溶液浸泡，然后参照HE 及Mosson 染色试剂盒说明书中的指导步骤分别进行HE、Mosson染色，常规漂洗、透明、脱水、封片后以显微镜观察，摄取每张切片任意5个视野图像。

1.2.4测定大鼠血清TGF-β1、IL-6、TNF-α 水平取出并解冻“1.2.2”中各组大鼠血清，参照ELISA 试剂盒说明书中的指导步骤：96 孔板经包被后分组加样，加酶标抗体37 ℃孵育1 h，洗涤后加底物液显色（37 ℃）30 min，然后终止反应并于450 nm 处测各孔吸光度，进而测定其中TNF-α、IL-6、TGF-β1水平。

1.2.5蛋白质印迹法 取出并解冻“1.2.2”中各组大鼠蛋白样品液，测定其中蛋白总浓度（具体参照BCA 试剂盒说明书中的指导步骤进行），根据结果将其调整至各组相同，取各组相同体积的样品液分别加入配制好的SDS-PAGE 浓缩胶上样孔中，跑电泳分离蛋白后湿转，最终将其转移至PVDF 膜后采用5%脱脂奶粉溶液封闭，2 h 后截取的目的蛋白NRG-1、p-ErbB3、ErbB3、GAPDH 条带，分别放入小盒中后加入相应的兔源抗大鼠一抗，4 ℃孵育过夜后回收一抗，然后采用TBST 漂洗后加入羊抗兔二抗，室温孵育2 h 后去除二抗，采用TBST 漂洗后以增强化学发光法显影，以凝胶成像仪摄取各目的蛋白条带图像，最后运用Image-J软件做分析后检测各目的蛋白相对表达。

1.3 统计学方法运用统计软件SPSS 24.0 对各种实验数据进行分析，并都使用xˉ±s表示，组间差异比较行采用单因素方差分析，两两之间进一步比较行LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 止麻消痰活血汤对大鼠左心室质量指数的影响相比假手术组，模型组大鼠左心室质量指数显著升高（P<0.05）。相比模型组，止麻消痰活血汤低剂量、中剂量及高剂量组、地尔硫䓬组大鼠左心室质量指数降低（P<0.05），止麻消痰活血汤各组之间呈剂量依赖性，相比地尔硫䓬组，止麻消痰活血汤高剂量组大鼠左心室质量指数差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 SD大鼠72只左心室质量指数比较/（‱，±s）

表1 SD大鼠72只左心室质量指数比较/（‱，±s）

注：①与假手术组比较，P<0.001。②与模型组比较，P<0.001。③与止麻消痰活血汤低剂量组比较，P<0.001。④与止麻消痰活血汤中剂量组比较，P<0.001。

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2.2 止麻消痰活血汤对大鼠心肌组织病理损伤的影响假手术组大鼠心肌结构正常、清晰、完好；与假手术组比较，模型组大鼠心肌纤维扭曲、断裂，心肌细胞肥大、坏死，可见炎性细胞浸润等病理损伤；相比模型组，止麻消痰活血汤低剂量、中剂量及高剂量组、地尔硫䓬组大鼠心肌病理损伤减轻，且止麻消痰活血汤各组之间逐渐减轻，止麻消痰活血汤高剂量组与地尔硫䓬组相比，大鼠心肌病理损伤减轻程度差异无统计学意义，见图1。

图1 检测大鼠心肌组织病理形态（HE染色×200） 图2 检测大鼠心室组织纤维化程度（Mosson染色×400）

2.3 止麻消痰活血汤对大鼠心室纤维化的影响假手术组大鼠心室组织中几乎无胶原纤维出现，纤维化症状未呈现；相比假手术组，模型组大鼠心室组织胶原纤维显著增加，纤维化症状严重；相比模型组，止麻消痰活血汤低剂量、中剂量及高剂量组、地尔硫䓬组大鼠心室组织胶原纤维减少，纤维化减轻，且止麻消痰活血汤各组之间逐渐减轻，相比地尔硫䓬组，止麻消痰活血汤高剂量组大鼠心室组织胶原纤维减少及纤维化症状减轻程度差异无统计学意义，见图2。

2.4 止麻消痰活血汤对大鼠血清TGF-β1、IL-6、TNF-α水平的影响相比假手术组，模型组大鼠血清TGF-β1、IL-6、TNF-α水平显著升高（P<0.05）。相比模型组，止麻消痰活血汤低剂量、中剂量及高剂量组、地尔硫䓬组大鼠血清TGF-β1、IL-6、TNF-α 水平降低（P<0.05），且止麻消痰活血汤各组之间呈剂量依赖性，相比地尔硫䓬组，止麻消痰活血汤高剂量组大鼠血清TGF-β1、IL-6、TNF-α水平差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 SD大鼠72只血清TGF-β1、IL-6、TNF-α水平/±s

注：TNF-α 为大鼠肿瘤坏死因子-α，IL-6 为大鼠白细胞介素-6，TGF-β1为大鼠转化生长因子-β1。①与假手术组比较，均P<0.001。②与模型组比较，均P<0.001。③与止麻消痰活血汤低剂量组比较，均P<0.001。④与止麻消痰活血汤中剂量组比较，均P<0.001。

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2.5 止麻消痰活血汤对大鼠心肌组织NRG-1/ErbB3 通路相关蛋白表达的影响相比假手术组，模型组大鼠心肌组织NRG-1/ErbB3 通路相关蛋白NRG-1、p-ErbB3/ErbB3 显著降低（P<0.05）。相比模型组，止麻消痰活血汤低剂量、中剂量及高剂量组、地尔硫䓬组大鼠心肌组织NRG-1/ErbB3通路相关蛋白NRG-1、p-ErbB3/ErbB3 升高（P<0.05），且止麻消痰活血汤各组之间呈剂量依赖性，相比地尔硫䓬组，止麻消痰活血汤高剂量组大鼠心肌组织NRG-1/ErbB3 通路相关蛋白NRG-1、p-ErbB3/ErbB3 差异无统计学意义（P>0.05），见图3，表3。

表3 各组大鼠心肌组织NRG-1/ErbB3通路相关蛋白相对表达/±s

表3 各组大鼠心肌组织NRG-1/ErbB3通路相关蛋白相对表达/±s

注：NRG-1 为神经调节蛋白-1，GAPDH 为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，p-ErbB3 为磷酸化受体酪氨酸蛋白激酶3，ErbB3 为受体酪氨酸蛋白激酶。①与假手术比较，均P<0.001。②与模型组比较，均P<0.001。③与止麻消痰活血汤低剂量组比较，均P<0.001。④与止麻消痰活血汤中剂量组比较，均P<0.001。

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图3 蛋白质印迹法检测大鼠心肌组织NRG-1/ErbB3通路相关蛋白表达

3 讨论

MI后心室重构的病理机制复杂，其中心梗后心肌组织会出现持续的缺血缺氧，活性氧及自由基过量产生，引发致纤维化因子TGF-β1 及致炎因子TNF-α、IL-6 过量合成，引发炎症及氧化应激损伤，另外救治时，血流的再灌注可进一步促使炎症发展，加重心肌损伤及纤维化变性，是引发心室重构的主要病理基础［14-16］。本研究通过SD 大鼠结扎冠状动脉左前降支来制备MI 老年大鼠模型，结果显示，模型组大鼠心肌纤维扭曲、断裂，心肌细胞肥大、坏死，可见炎性细胞浸润等病理损伤，且胶原纤维显著增多，纤维化变性症状严重，血清TGF-β1、IL-6及TNF-α水平、左心室质量指数显著升高，表明阻止冠状动脉血流可促使炎症因子及致纤维化因子表达，诱导炎症反应，引发心肌损伤、纤维化变性及心肌肥大，最终造成心室病理性重构，揭示模型建立成功。

MI作为中医理论中胸痹心痛的一种，以温通心阳为基，配以行气、活血、消痰，标本兼治为主要治疗方法，具有益气、消痰、化痰、活血功效的中药方剂可减轻再灌注损伤，改善MI 病人心功能［8-9，17］。止麻消痰活血汤主要由黄芪、半夏、胆南星、赤芍、桃仁、甘草等药物组成，黄芪益气健脾；半夏化痰除湿、消痞散结；胆南星清热祛痰，息风定惊；赤芍凉血清热，止痛散瘀；桃仁活血祛瘀；甘草调和诸药等，诸药合用，可消痰扶正、活血益气、祛痰化浊、化瘀通脉，可改善冠心病心绞痛病人血脂指标，修复心室功能，有效缓解其临床症状［10-11，18］，因而推测该方剂可改善MI后心室重构症状。本研究显示，采用止麻消痰活血汤干预MI老年大鼠，可缓解其病理损伤及纤维化变性症状，降低血清TGF-β1、IL-6 及TNF-α 水平、左心室质量指数，且呈剂量依赖性，表明止麻消痰活血汤可抑制致纤维化及致炎因子表达，降低炎症水平，缓解MI老年大鼠心肌损伤及病理性肥大症状，延缓其心肌纤维化变性与心室重构。

NRG-1/ErbB3 是重要的心脏保护通路，NRG-1与广泛分布于心肌细胞表面的ErbB3 结合后，可通过调控下游PI3K/AKT、ERK 等信号途径传导，减轻MI 后炎症及氧化应激，缓解其心肌肥大及病理损伤，延缓心室重塑，降低心脏衰竭发生的风险，保护心脏功能［7，19-20］，本研究结果显示，老年MI 大鼠心肌组织中NRG-1/ErbB3 通路相关蛋白NRG-1、p-ErbB3/ErbB3 显著降低，以止麻消痰活血汤治疗后，NRG-1、p-ErbB3/ErbB3 显著升高，呈剂量依赖性，表明NRG-1/ErbB3 通路在老年MI 大鼠心室重塑过程中发挥重要调控作用，止麻消痰活血汤可上调NRG-1表达，增强ErbB3磷酸化，进而保护心脏病理损伤，改善心室重构。

综上所述，止麻消痰活血汤可能通过激活NRG-1/ErbB3 信号通路，降低炎性因子及致纤维化因子表达，减轻MI 所致心肌损伤及纤维化变性，缓解心室重构，保护心功能，为临床改善MI预后，降低心室重构发生的风险提供了新参考，但本研究尚未通过促进或抑制NRG-1/ErbB3信号传导进行对照验证，存在一定不足，还需后续的实验进行深入探讨。