阿米卡星调控微小RNA-223对脂多糖诱导的肺泡上皮细胞凋亡以及肿瘤坏死因子α、白细胞介素6表达的影响

孙利平，宋亚玲，李春艳

作者单位：枣庄矿业集团中心医院儿科，山东 枣庄 277000

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种常见的肺部疾病，表现为肺容积减少、顺应性降低、通气/血流量不平衡、急性和持续性肺部炎症、弥漫性肺泡损伤，最终导致血氧不足和呼吸衰竭［1-2］。阿米卡星是一种常用的氨基糖苷类抗生素，其通过抑制蛋白质合成，破坏细菌细胞壁完整性，对革兰阴性杆菌、青霉素耐药金黄色葡萄球菌感染均具有较强的抗菌作用［3］。文献资料显示，阿米卡星和头孢他啶的联用可有效降低单独用药带来的并发症和不良反应，对社区获得性肺炎病人疗效显著［4-5］。此外，阿米卡星和头孢地嗪联用还可明显抑制肺炎克雷伯氏菌感染引起的胸腺细胞凋亡［6］。然而，阿米卡星对急性肺损伤是否具有保护作用尚未可知。脂多糖（LPS）是革兰阴性菌细胞外膜重要组成部分，其通过激活机体免疫细胞刺激宿主细胞分泌炎性细胞因子，参与机体炎症反应。目前，LPS诱导的肺泡上皮细胞已被广泛用于急性肺损伤机制研究［7-8］。本研究通过探讨阿米卡星对LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡、炎症反应的影响，初步探索其可能分子机制，以期为阿米卡星在ALI中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料大鼠肺泡上皮细胞、Ham's F-12K培养液购于武汉普诺赛生命科技有限公司；脂多糖购于美国Sigma 公司；阿米卡星（海康朗生物科技有限公司，CAS 号37517-28-5，纯度≥98%）；miR-223 模拟物（mimics）及其对照（miR-NC）、miR-223 抑制物（anti-miR-223）及其对照（anti-miR-NC）由上海生工公司提供；膜联蛋白-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒、免疫沉淀裂解缓冲液、硝酸纤维素膜、二喹啉甲酸（Bicin‑choninic acid，BCA）、Trizol 法试剂盒购于上海碧云天公司；兔源裂解的胱天蛋白酶3（cl-caspase3）抗体、胱天蛋白酶3 前体（pro-caspase3）抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、山羊抗兔IgG 二抗购于上海艾博抗公司；大鼠肿瘤坏死因子α（tumor ne‑crosis factor α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购于上海钰博生物；PrimeScript RT 试剂盒、SYBR Green Master Mix购于大连Takara公司。

1.2 细胞培养和实验分组实验于2020 年1—7 月完成，大鼠肺泡上皮细胞采用Ham's F-12K 培养液（添加10%胎牛血清、1%青链霉素双抗）于含95%空气、5%二氧化碳的37 ℃恒温细胞培养箱中培养。取对数期生长良好的细胞进行实验，实验分组如下：对照组（不作处理）、模型组（15 mg/L 的LPS处理细胞24 h）、实验组（加入15 mg/L 的LPS+不同浓度的阿米卡星处理细胞24 h，实验1组、实验2组、实验3组阿米卡星浓度分别为5µg/L、10µg/L、15µg/L）、anti-miR-NC 组（转染微小RNA 阴性对照后用15 mg/L 的LPS 处理细胞24 h）、anti-miR-223 组（转染微小RNA-223 抑制剂后用15 mg/L 的LPS 处理细胞24 h）、实验3+miR-NC组（转染微小RNA 阴性对照后进行15 mg/L的LPS和15µg/L的阿米卡星处理）、实验3+miR-223 组（转染微小RNA-223 激动剂后进行15 mg/L的LPS和15µg/L的阿米卡星处理）。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡收集肺泡上皮细胞，采用PBS液洗涤细胞2次。用1×结合缓冲液调整为密度为1×106个/毫升的单细胞悬液。取100µL细胞悬液，按照细胞凋亡检测试剂盒步骤分别加入An‑nexin V-FITC和PI，室温避光孵育15 min，补加400µL的1×结合缓冲液，混匀后进行流式细胞术检测。

1.4 Western blotting 检测cl-caspase3、pro-cas⁃pase3 表达采用含有蛋白酶抑制剂的预冷免疫沉淀裂解缓冲液分离总蛋白，BCA 法进行蛋白定量。取30µg 蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离的细胞蛋白转移到硝酸纤维素膜。5%脱脂乳4 ℃封闭膜过夜，然后分别与稀释的一抗、二抗室温孵育2 h。GAPDH 作为内部对照，增强型化学发光试剂进行显色，QuantityOne 软件分析目的蛋白表达水平。

1.5 ELISA 试剂盒检测细胞上清液中TNF-α、IL-6水平收集各组细胞培养液上清，用DMEM 培养液配制标准品。参照ELISA试剂盒说明书检测细胞上清液中TNF-α、IL-6的含量。

1.6 RT-qPCR 检测miR-223 表达Trizol 法 提 取细胞总RNA，微量分光光度计测定RNA浓度。利用PrimeScript RT 试剂盒合成单链互补DNA，-20 ℃保存备用。利用SYBR Green Master Mix 试剂进行qP‑CR检测，2-ΔΔCt法分析miR-223的表达水平。

miR-223：正向引物5′-AGCTGGTGTTGTGAAT‑CAGGCCG-3′，反 向 引 物 5′-TGGTGTCGTG‑GAGTCG-3′。U6：正向引物5′-CTCGCTTCGGCAG‑CACATATACT-3′，反 向 引 物5′-ACGCTTCAC‑GAATTTGCGTGTC-3′。

1.7 统计学方法采用SPSS 18.0 软件进行统计分析，每组设置3 个平行实验，重复3 次，数据以xˉ±s表示。采用t检验评估两组间差异；采用单因素方差分析评估多组间差异，进一步两组间比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阿米卡星对LPS 作用肺泡上皮细胞凋亡的影响与对照组比较，模型组肺泡上皮细胞凋亡率、cl-caspase3 蛋白表达增加，pro-caspase3 蛋白表达降低；与模型组比较，实验组肺泡上皮细胞凋亡率、clcaspase3 蛋白表达降低，pro-caspase3 蛋白表达升高（P<0.05）。见图1，表1。

图1 阿米卡星对脂多糖作用肺泡上皮细胞凋亡（A）及cl-caspase3、pro-caspase3蛋白（B）表达的影响

表1 阿米卡星对脂多糖作用肺泡上皮细胞凋亡的影响/±s

表1 阿米卡星对脂多糖作用肺泡上皮细胞凋亡的影响/±s

注：cl-caspase3 为兔源裂解的半胱天冬酶-3，pro-caspase3 为半胱天冬酶-3酶原。①与对照组相比，P<0.05。②与模型组相比，P<0.05。

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2.2 阿米卡星对LPS作用肺泡上皮细胞中TNF-α、IL-6 表达的影响与对照组比较，模型组肺泡上皮细胞培养液上清中TNF-α、IL-6 含量显著升高；与模型组比较，实验组肺泡上皮细胞培养液上清中TNFα、IL-6含量显著降低（P<0.05）。见表2。

表2 阿米卡星对脂多糖作用肺泡上皮细胞中TNF-α、IL-6表达的影响/（ng/L，±s）

表2 阿米卡星对脂多糖作用肺泡上皮细胞中TNF-α、IL-6表达的影响/（ng/L，±s）

注：TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL-6为白细胞介素6。①与对照组相比，P<0.05。②与模型组相比，P<0.05。

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2.3 阿米卡星对LPS 作用肺泡上皮细胞中miR-223 表达的影响与对照组1.00±0.06 比较，模型组肺泡上皮细胞中miR-223 表达显著升高（P<0.05）；与模型组5.35±0.14 比较，实验组肺泡上皮细胞中miR-223 表达（实验1 组4.26±0.14，实验2 组3.54±0.12，实验3 组1.89±0.10）显著降低（P<0.05）。对照组、模型组、实验组肺泡上皮细胞中miR-223表达比较，差异有统计学意义（F=2 078.82，P<0.001）。

2.4 抑制miR-223 对LPS 作用肺泡上皮细胞凋亡及TNF-α、IL-6 表达的影响与anti-miR-NC 组比较，anti-miR-223 组肺泡上皮细胞miR-223 和cl-cas‑pase3 蛋白表达、细胞凋亡率显著降低，pro-caspase3蛋白表达显著增加，细胞培养液上清中TNF-α、IL-6含量显著降低（P<0.05）。见图2，表3。

图2 抑制miR-223对脂多糖作用肺泡上皮细胞凋亡（2A）及cl-caspase3、pro-caspase3蛋白（2B）表达的影响 图3 miR-223可逆转阿米卡星对脂多糖作用肺泡上皮细胞凋亡（3A）及cl-caspase3、pro-caspase3蛋白（3B）表达的影响

表3 抑制miR-223对脂多糖作用肺泡上皮细胞凋亡及TNF-α、IL-6表达的影响/±s

注：anti-miR-NC 为miR 阴性对照，anti-miR-223 为miR-223 抑制剂，miR-223 为微小RNA-223，cl-caspase3 为兔源裂解的半胱天冬酶-3，procaspase3为半胱天冬酶-3酶原，TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL-6为白细胞介素6。

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2.5 miR-223 可逆转阿米卡星对LPS 作用肺泡上皮细胞凋亡及TNF-α、IL-6 表达的影响与实验3+miR-NC 组比较，实验3+miR-223 组肺泡上皮细胞miR-223 表达、cl-caspase3 蛋白表达、细胞凋亡率显著升高，pro-caspase3 蛋白表达显著降低，细胞培养液上清中TNF-α、IL-6 含量显著升高（P<0.05）。见图3，表4。

表4 miR-223可逆转阿米卡星对脂多糖作用肺泡上皮细胞凋亡及TNF-α、IL-6表达的影响/±s

表4 miR-223可逆转阿米卡星对脂多糖作用肺泡上皮细胞凋亡及TNF-α、IL-6表达的影响/±s

注：miR-223 为微小RNA-223，cl-caspase3 为兔源裂解的半胱天冬酶-3，pro-caspase3 为半胱天冬酶-3 酶原，TNF-α 为肿瘤坏死因子α，IL-6为白细胞介素6。

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3 讨论

既往研究显示，雾化吸入阿米卡星脂质体混悬液除用于治疗禽结核菌引起的难治性非结核分枝杆菌肺病外，还可治疗慢性铜绿假单胞菌引起的呼吸机相关性肺炎，提高病人细菌清除率、治愈率，降低促炎因子分泌［9-11］。本研究显示LPS 诱导后肺泡上皮细胞凋亡率、cl-caspase3 蛋白表达显著升高，pro-caspase3蛋白表达显著降低，阿米卡星干预呈剂量依赖性地抑制cl-caspase3 蛋白表达，促进pro-cas‑pase3 蛋白表达，减轻LPS 诱导的肺泡上皮细胞凋亡。当机体受到LPS 刺激时，会释放一系列促炎细胞因子如TNF-α，而TNF-α 也可激活中性粒细胞促进IL-6 等炎性因子的释放，进一步扩大炎症反应［12］。本研究显示LPS 诱导后TNF-α、IL-6 分泌量显著升高，而阿米卡星干预可显著抑制TNF-α、IL-6分泌。此外，随着阿米卡星浓度逐渐增加，其对TNF-α、IL-6 分泌抑制作用逐渐增强。以上研究说明阿米卡星能够改善LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应，进而起到肺泡上皮细胞损伤保护作用。

miR-223 是一种造血细胞特异性微小RNA（mi‑croRNA，miRNA），它参与调节自然免疫稳态和结核分枝杆菌诱导的应激反应，与NF-κb 依赖性巨噬细胞分化、炎症、感染和肿瘤进展有关［13-14］。近年研究显示，miR-223 在重症肺炎病儿血浆中表达显著增加，是重症肺炎早期诊断、判断炎症严重程度的重要指标［15-16］。在内毒素血症小鼠肺组织中miR-223也呈高表达［17］。此外，有研究指出miR-223 从中性粒细胞向肺上皮细胞的细胞间转移可能通过抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 表达而减轻ALI［18-19］。本研究发现LPS 诱导后肺泡上皮细胞miR-223 表达显著增加，而阿米卡星干预显著降低miR-223 的表达水平，于是推测阿米卡星对LPS 诱导的肺泡上皮细胞损伤的保护作用可能与调控miR-223 表达有关。进一步研究显示，抑制miR-223 表达可抑制clcaspase3 蛋白表达，促进pro-caspase3 蛋白表达，抑制TNF-α、IL-6 分泌，减轻LPS 诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应，与阿米卡星对肺泡上皮细胞损伤的保护作用一致。深入研究发现，上调miR-223 表达还可逆转阿米卡星对LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症损伤的保护作用。以上研究提示下调miR-223 表达可能是阿米卡星发挥肺泡上皮细胞保护作用的重要机制。

综上，本研究发现阿米卡星显著降低了LPS 诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应，其机制可能与下调miR-223 表达有关。这为阿米卡星在ALI 中的应用奠定了实验基础。