黑老虎根提取物调控微小RNA-193对肝星状细胞HSC-T6增殖凋亡的影响

范玉梅，赵明，赵媛，刘俊英

作者单位：周口市中心医院消化科，河南 周口 466330

肝纤维化（liver fibrosis）是多种原因引起的慢性肝损伤所致的病理改变，其最终可致肝硬化、肝功能紊乱，主要表现为细胞外基质（ECM）的过度沉积［1］。研究表明肝星状细胞（HSCs）的激活在肝纤维化发展过程中起关键作用，HSCs活化可导致细胞外基质的增加，这是肝纤维化形成并最终导致肝硬化、肝功能衰竭的主要原因；因此抑制HSCs 活化、增殖，进而减少ECM 合成是目前阻断、逆转肝纤维化的重要策略［2］。研究显示多种中药可发挥抗肝纤维化作用，通过直接作用于HSCs实现［3］。黑老虎根是五味子科五味子属植物的干燥根，其具有抗氧化、抗炎等作用［4］。有研究表明黑老虎根提取物可减少脂质在肝脏的沉积、减轻过氧化损伤，对大鼠非酒精性脂肪肝具有调节脂质和保护肝脏的作用［5］。黑老虎根提取物对肝星状细胞（HSC-T6）细胞的增殖具有抑制作用［6］。以上研究表明黑老虎根提取物可能具有抗纤维化作用。miR-193 在实验性肝损伤大鼠［7］、肝癌［8］中低表达，其是否参与对HSCT6 细胞的调控还未见研究。因此，本研究通过研究黑老虎根提取物对HSC-T6 增殖、凋亡的影响以及miR-193 过表达在其中的作用，为黑老虎根提取物的临床应用以及miR-193的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料研究起止时间为2018年10月至2019年12 月。大鼠HSC-T6 细胞（CL-0116）购自武汉普诺赛，黑老虎根提取物购自西安金绿，细胞周期检测试剂盒（E-CK-A351）购自武汉Elabsscience 公司，细胞计数（CCK-8）试剂盒（C0039）、二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（P0012）、凋亡试剂盒（C1062L）、定量即时聚合酶链锁反应（RT-qPCR）所用试剂盒（D7260）购自上海碧云天。细胞增殖核抗原（Ki67）（ab16667）、活化胱天蛋白酶-3（Cleaved caspase-3）（ab32042）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（ab9485）、二抗（ab6728）购自abcam公司。

1.2 细胞培养与分组HSC-T6细胞培养液选择RP‑MI-1640（含10%小牛血清），分别用1.5 mg/L、3.0 mg/L、6.0 mg/L黑老虎根提取物处理对数生长期HSC-T6细胞，记为实验1、2、3组；另选取未加黑老虎根提取物的HSC-T6细胞作为对照组。将miR-NC、miR-193转染至HSC-T6细胞中，记为miR-NC组、miR-193组；将anti-miR-NC、anti-miR-193 分别转染至HSC-T6 细胞中再用6.0 mg/L黑老虎根提取物处理，记为实验3+an‑ti-miR-NC组、实验3+anti-miR-193组。

1.3 流式细胞仪检测HSC-T6 细胞周期收集培养48 h 的“1.2”中的各组HSC-T6 细胞（2×105个），磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤后离心去上清，乙醇（70%）固定（-20 ℃，4 h），离心（350g，5 min），PBS洗涤，加入碘化啶（PI）（浓度为50 mg/L）与RNaseA（孵育15 min），上机测定，分析各组HSC-T6 细胞G0-G1期、S期、G2-M期细胞比例。

1.4 CCK-8 检测HSC-T6 细胞存活率收集培养48 h 的“1.2”中各组HSC-T6 细胞，加入10µL CCK-8试剂/孔，孵育2 h 后，酶标仪测定各组HSC-T6 细胞吸光度（A）值（490 nm 处）。细胞存活率（%）=A实验组/A对照组×100%。实验重复3次。

1.5 蛋白质印迹法（Western blotting）检测HSCT6 细胞Ki67、Cleaved caspase-3 蛋白表达提取HSC-T6 细胞总蛋白并对提取蛋白进行定量（BCA法）。蛋白（50 µL）行SDS-PAGE 电泳，湿法转移到PVDF 膜，封闭1 h；加入Ki67、Cleaved caspase-3、GAPDH（内参）抗体，Ki67、Cleaved caspase-3 稀释比为1∶1 000，GAPDH 稀释比为1∶5 000；过夜后添加二抗培养1 h，稀释比为1∶5 000，测定Ki67、Cleaved caspase-3蛋白灰度值。实验重复3次。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡收集培养48 h 的“1.2”中各组HSC-T6细胞，PBS漂洗2次，Annexin VFITC 试剂盒处理HSC-T6 细胞，避光孵育10 min，上机检测HSC-T6细胞凋亡率。实验重复3次。

1.7 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-193表达水平收集培养48 h的“1.2”中各组HSC-T6细胞，提取总RNA，经反转录成互补DNA（cDNA），进行PCR扩增。miR-193 以U6 为内参，miR-193：正向引物AACTGGCCTACAAAGTC-3， 反 向 引 物 GTG‑CAGGGTCCGAGGT。U6：正向引物GCTTCGGCAG‑CACATATACTAAAAT，反 向 引 物 CGCTTCAC‑GAATTTGCGTGTCAT。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

1.8 统计学方法采用SPSS 20.0 软件进行此研究数据分析，计量资料用±s表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黑老虎根提取物对HSC-T6 细胞细胞周期分布与对照组、实验1 组相比，实验2、实验3 组G0-G1期细胞比例升高，S期细胞比例降低，且呈浓度依赖性（均P<0.05），而各组G2-M 期细胞所占比例差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 黑老虎根提取物对肝星状细胞HSC-T6细胞周期的影响/（%，±s）

表1 黑老虎根提取物对肝星状细胞HSC-T6细胞周期的影响/（%，±s）

注：①与对照组相比，P<0.05。②与实验1 组相比，P<0.05。③与实验2组相比，P<0.05。

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2.2 黑老虎根提取物对肝星状细胞HSC-T6 细胞活性的影响CCK-8 及Western blotting 检测结果显示，与对照组和实验1 组相比，实验2、3 组细胞存活率降低，Ki67 表达水平降低，且呈浓度依赖性（P<0.05），见图1，表2。

图1 黑老虎根提取物对肝星状细胞HSC-T6细胞Ki67蛋白表达的影响

表2 黑老虎根提取物对纤维化肝细胞细胞活性及Ki67的影响/±s

表2 黑老虎根提取物对纤维化肝细胞细胞活性及Ki67的影响/±s

注：Ki67为细胞增殖核抗原。①与对照组相比，P<0.05。②与实验1组相比，P<0.05。③与实验2组相比，P<0.05。

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2.3 黑老虎根提取物对肝星状细胞HSC-T6 凋亡的影响流式细胞术及Western blotting 检测结果显示，与对照组和实验1 组相比，实验2、3 组细胞凋亡率升高，Cleaved caspase-3 表达水平升高，且呈浓度依赖性（P<0.05），见表3。

表3 黑老虎提取物对纤维化肝细胞凋亡的影响/±s

表3 黑老虎提取物对纤维化肝细胞凋亡的影响/±s

注：Cleaved caspase-3为活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3。①与对照组相比，P<0.05。②与实验1组相比，P<0.05。③与实验2组相比，P<0.05。

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2.4 黑老虎根提取物对肝星状细胞HSC-T6 中miR-193 表达的影响RT-qPCR 检测结果显示，与对照组（0.92±0.04）和实验1 组（0.93±0.05）相比，实验2、3 组miR-193 表达水平（1.65±0.05、2.69±0.07）升高，且呈浓度依赖性（F=727.26，P<0.001）。

2.5 过表达miR-193对肝星状细胞HSC-T6细胞周期、细胞活性及凋亡的影响与miR-NC 组相比，miR-193 组miR-193 表达水平升高，G0-G1 期细胞比例升高，S 期细胞比例降低（均P<0.05）；细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，Ki67表达水平降低，Cleaved caspase-3表达水平升高（均P<0.05），见图2，表4。

图2 miR-193对肝星状细胞HSC-T6细胞凋亡（2A）、细胞活性（2B）的影响 图3 抑制miR-193可逆转黑老虎根提取物对肝星状细胞HSC-T6细胞凋亡（3A）及凋亡相关蛋白表达（3B）的影响

表4 过表达miR-193对肝星状细胞HSC-T6细胞周期、细胞活性及凋亡的影响/±s

表4 过表达miR-193对肝星状细胞HSC-T6细胞周期、细胞活性及凋亡的影响/±s

注：Ki67为细胞增殖核抗原，Cleaved caspase-3为活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3。

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2.6 抑制miR-193 表达逆转了黑老虎根提取物对肝星状细胞HSC-T6 细胞周期、细胞活性及凋亡的影响与实验3+anti-miR-NC 组相比，实验3+antimiR-193 组细胞存活率升高，细胞凋亡率降低，G0-G1期细胞所占比例降低，S期细胞所占比例升高（均P<0.05）；Ki67表达水平升高，Cleaved caspase-3表达水平降低（均P<0.05），见图3，表5。

表5 抑制miR-193可逆转黑老虎根提取物对肝星状细胞HSC-T6细胞周期、细胞活性及凋亡的影响/±s

表5 抑制miR-193可逆转黑老虎根提取物对肝星状细胞HSC-T6细胞周期、细胞活性及凋亡的影响/±s

注：Ki67为细胞增殖核抗原，Cleaved caspase-3为活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3。

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3 讨论

肝纤维化是肝脏慢性炎症进一步向肝硬化、肝癌发展的重要环节；而肝纤维化的形成是由多细胞，多因子共同参与的复杂病理过程［9-11］。HSCs 是肝脏细胞外基质的重要来源，其可合成并分泌细胞外基质，并促进肝细胞的正常增殖，肝星状细胞激活是肝纤维化形成的重要原因之一［12］，因此，抗纤维化治疗可以HSCs 为靶向细胞，研究显示，垂盆草总黄酮可通过Smads通路对HSCs细胞活化抑制发挥抗肝纤维化作用［13］；GATA6 抑制HSC 活化抗肝纤维化［14］。以上研究均佐证HSCs在抗肝纤维化中的作用。

近年来研究表明中药能够多途径，多靶点作用于HSCs，诱导HSCs 凋亡、减少活化的HSCs，从而发挥抗肝纤维化作用［3］，如乌兰十三味汤可调节HSCs活化抑制肝纤维化［15］。黑老虎根来源于植物冷饭团，具有抗炎、镇痛作用，已有研究表明黑老虎根提取物具有保护肝脏的作用［7］。此外，来自黑老虎根的二苯并环辛二烯木脂素和羊毛甾烷衍生物对叔丁基过氧化氢诱导的原代大鼠肝细胞损伤也具有保护作用［16］。本研究用不同浓度的黑老虎根提取物处理肝星状细胞HSC-T6，研究黑老虎根提取物对HSC-T6 增殖、凋亡的影响，结果显示，3.0 mg/L、6.0 mg/L黑老虎根提取物处理的HSC-T6中，G0-G1期细胞比例较未经处理HSC-T6细胞高，而S期细胞比例则降低，提示3.0 mg/L、6.0 mg/L 浓度的黑老虎根提取物可促使HSC-T6 细胞S 期阻滞，通过调控HSC-T6 细胞生长周期控制细胞增殖进程。研究显示HSC-T6 细胞存活率、Ki67 表达降低，而凋亡率、cleaved caspase-3 升高，提示3.0 mg/L、6.0 mg/L 浓度的黑老虎根提取物发挥抑制HSC-T6 细胞增殖、促进HSC-T6 细胞凋亡。而1.5 mg/L 黑老虎根提取物处理的HSC-T6 中各指标均差异无统计学意义。说明浓度过低的黑老虎根提取物对HSC-T6 细胞存活、凋亡无作用。

研究表明miRNA 可调控HSCs 的活化、增殖、凋亡等，在肝纤维化发生发展中起着重要的作用［17］，其中miR-193 在肝纤维化过程中表达水平降低［18］。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）是HSCs 活化的标志性分子，研究报道miR-193 能抑制活化型HSCs 中肝纤维化相关基因α-SMA 的表达［19］。miR-193 是转化生长因子Beta（TGF-β）依赖性调节网络的一部分，可控制肝纤维化中的细胞外基质基因［20］。miR-193 在实验性肝损伤大鼠中低表达，miR-193过表达可降低肝损伤大鼠α-SMA 蛋白表达［8］。本实验结果显示，miR-193过表达可升高G0-G1期细胞比例，并降低S期细胞比例；同时降低HSC-T6细胞存活率、Ki67表达，并升高细胞凋亡率与cleaved caspase-3。说明过表达miR-193可调控HSC-T6细胞周期、抑制HSC-T6细胞增殖、促进细胞凋亡。且本研究还发现3.0 mg/L、6.0 mg/L黑老虎根提取物处理的HSC-T6细胞中miR-193表达水升高；而抑制miR-193表达逆转了黑老虎根提取物对HSC-T6细胞抑增殖、促凋亡作用。

综上所述，黑老虎根提取物可抑制HSC-T6 细胞恶性化增殖，可能与黑老虎根提取物上调miR-193 表达相关；可为肝纤维化的治疗提供新方法和新靶点。