三维同步荧光光谱法同时测定保健食品中维生素B1、B2和B6的含量

张宝成，高 岚

(1.安徽中医药高等专科学校，安徽 芜湖 241002；2.芜湖市诺康生物科技有限公司，安徽 芜湖 241007)

B族维生素是维持人体正常机能与代谢活动不可缺少的水溶性维生素，维生素B1、B2和B6常同时存在于复合维生素B保健食品中。准确检测三种维生素的含量一直受到人们的关注，同时测定多种维生素B常用的方法是高效液相色谱法[1-2]。荧光分析法具有高的灵敏性和选择性，而且用量少、操作简单。而维生素B2和B6本身具有荧光性，维生素B1在碱性介质中氧化后的产物也具有荧光性，因此，荧光分析法是检测维生素B1、B2和B6的重要方法之一。但是，由于维生素B1、B2和B6的发射光谱重叠严重，且最佳激发光波长相差较大，因此，很难用普通荧光光谱法同时准确测定三种维生素的含量。同步荧光技术是荧光分析技术的进一步发展，与普通荧光法相比较，同步荧光法得到的荧光光谱更为窄化，可以减少几种成分的普通荧光光谱的重叠程度[3]，在测定混合物时较普通荧光法优势明显[4]。同步荧光法的关键是确定合适的波长间隔(Δλ)。最佳Δλ值可以通过斯托克斯位移大小作出理论上的预测，但实际上合适的Δλ需要实验来确认[5]。通常选择Δλ的方法是先确定几个值，再通过比较选出相对理想的Δλ值，但是由于Δλ是预先设定的几个值，选出的Δλ值可能不是最佳Δλ。而三维同步荧光光谱可以扫描一系列Δλ与同步荧光光谱的关系，从中得到最佳Δλ，更接近于实际最佳Δλ，所以三维荧光与同步荧光荧光能更全面地表达样品信息[6]。三维同步荧光已经应用于食品分析领域[7]。本研究通过建立维生素B1、B2和B6三维同步荧光光谱，选择合适的Δλ，运用同步荧光法同时测定保健食品中维生素B1、B2和B6的含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

Cary Eclipse型荧光分光光度计(美国安捷伦科技公司)，DV215CD 型十万分之一电子天平(美国奥豪斯公司)。

维生素B1对照品购于上海诗丹德标准技术服务有限公司，维生素B2和B6对照品购于德国Dr.Ehrenstorfer公司；奥诺康®多种B族维生素片，规格：0.5 g/片，购于芜湖市诺康生物科技有限公司，批号：211009。

pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液按照《中华人民共和国药典》[8]中的方法配备。碱性铁氰化钾溶液的配备：称取1.0 g铁氰化钾配成100 mL铁氰化钾溶液，使用时取铁氰化钾溶液3 mL，用2 mol/L的氢氧化钠溶液稀释至10 mL，现配现用。

1.2 实验方法

1.2.1 维生素B混合对照品溶液的制备

准确称取维生素B1、B2、B2对照品各10.00 mg，在100 mL容量瓶(本文使用的容量瓶均为棕色)中用0.01 mol/L的盐酸配成 100 μg/mL储备液。准确量取10.00 mL三种维生素储备液至同一100 mL容量瓶中，加入20 mL 0.01 mol/L的盐酸，再加入1.2 0 mL碱性铁氰化钾溶液，摇均放置10 min后，用0.01 mol/L盐酸定容。分别量取上述混合对照品溶液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL至5个10 mL容量瓶中，用pH为6.8缓冲溶液定容，配成系列浓度的混合对照品溶液，待测。

1.2.2 供试品溶液的制备

随机选样品 10片研细，精密称取1.000 0 g，用0.01 mol/L盐酸溶解，并在100 mL容量瓶中定容，作为样品储备液。准确量取25.00 mL样品储备液至100 mL容量瓶中，先加入25 mL 0.01 mol/L的盐酸，接着加入1.20 mL碱性铁氰化钾溶液，摇均放置10 min后，再用0.01 mol/L盐酸定容。上述供试品溶液经10 000 r/min离心5 min，取离心液1.00 mL至10 mL容量瓶中，用pH为6.8缓冲溶液定容，待测。

1.2.3 三维同步荧光光谱的测定

选择激发光谱和发射光谱通带宽度均为 5 nm，Δλ扫描范围为 40～120 nm，增量为5 nm，扫描混合对照品溶液和供试品溶液的三维同步荧光光谱，做出等高线图谱和立体图谱，确定同时测定三种维生素的最佳Δλ值。

1.2.4 维生素B含量的测定

在Δλ=72 nm 的条件下，测定系列浓度混合对照品溶液的同步荧光强度，绘制标准曲线，得出回归方程式。然后在相同的条件下测定供试品的同步荧光强度，根据回归方程式算出三种维生素B的含量。

2 实验结果

2.1 荧光光谱

维生素B1、B2和B6的普通荧光光谱和同步荧光光谱如图1 所示，可以看出，三种维生素的普通荧光光谱重叠严重(图1a)，而同步荧光的谱带更加窄化，光谱重叠现象减少(图1b)。

(a)普通荧光光谱

2.2 三维荧光光谱

2.2.1 三维普通荧光光谱

维生素B1、B2和B6的三维普通荧光光谱如图2所示。等高线图显示，三种维生素B的激发波长不存在共同波段。立体图显示激发波长的改变对荧光发射强度影响较大，因此，普通荧光光谱法难以同时准确测定三种维生素的含量。

(a)维生素B1三维普通荧光光谱等高线图 (b)维生素B1三维普通荧光光谱立体图

2.2.2 三维同步荧光光谱

维生素B1、B2和B6的三维同步荧光光谱如图3所示。

(a)维生素B1三维同步荧光光谱等高线图 (b)维生素B1三维同步荧光光谱立体图

通过进一步减小Δλ的增量进行扫描，得到维生素B1最佳Δλ是72 nm，维生素B2最佳Δλ是76 nm，维生素B6最佳Δλ是68 nm。但是等高线图和立体图都显示，尽管三种维生素B的同步发射谱带较狭窄，但是其Δλ更为宽泛，即Δλ在一定的范围内对同步发射影响较小，因此可以选择适当的波长作为维生素B1、B2和B6的共同Δλ。根据进一步减小增量扫描的结果，确定72 nm作为共同的Δλ。

维生素B1、B2和B6混合对照品的三维同步荧光光谱如图4所示，同样显示Δλ=72 nm时，三种维生素的同步发射信号都处于最强点或极接近最强点(图4a)。以Δλ=72 nm扫描混合对照品得到的同步光谱显示，三种维生素较好地保持了各自的同步发射峰(图4b)。

(a)普通同步荧光光谱 (b)三维同步荧光光谱图4 混合对照品的同步荧光光谱

供试品溶液的三维同步荧光光谱(图5a)和以Δλ=72 nm扫描得到的同步光谱(图5b)都显示与混合对照品光谱具有类似的特征。

(a)普通同步荧光光谱 (b)三维同步荧光光谱图5 样品的同步荧光光谱

2.3 标准曲线与检出限

以Δλ=72 nm扫描系列浓度混合对照品溶液同步荧光光谱，再以质量浓度为横轴(X)，荧光强度为纵轴(Y)进行回归分析，结果如表1所示，三种维生素B在0.25～2.00 μg/mL范围内线性良好。检出限D=3×Sb/S，Sb为空白试样测试 11 次的标准偏差,S为回归方程的斜率，得到三种维生素的检出限(表1)。

表1 三种维生素的线性关系与检出限

2.4 精密度考察

取同一份样品供试液，按照“1.2.4”方法测定6次，测得维生素B1、B2和B6同步荧光峰强度值RSD分别为0.33%、0.29%和0.24%，说明仪器精密度良好。

2.5 重复性考察

称取样品6份，按“1.2.4”方法制备供试液，以Δλ=72 nm测定维生素B1、B2、B6同步荧光光谱，并计算含量，所得结果的RSD分别为4.64%、2.54%和3.72%，说明该方法重复性较好。

2.6 加样回收率实验

量取6份已知浓度的样品供试液(维生素B1：7.66 μg/mL，维生素B2：7.59 μg/mL，维生素B6：7.43 μg/mL)，加入与样品含量大致相当的混合标准品液，按照“1.2.4”方法测试，维生素B1、B2和B6的平均回收率分别为101.03%、100.18%和98.33%，RSD 分别为4.13%、1.95%和2.32%，表明此方法回收率较好。结果见表 2。

表2 加标回收率实验结果

2.7 样品测定

按照“1.2.4 ”方法测定样品中三种维生素的含量，以1.000 0 g原样含量计，结果见表3“同时测定”。同时，以三种维生素B以各自的最佳Δλ进行测定，即维生素B1的Δλ为72 nm(与同时测定相同，不再进行单独测定)、维生素B2的Δλ为76 nm、维生素B6的Δλ为68 nm，测得结果见表3“分别测定”。两种方法测得的结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 样品中三种维生素B含量测定结果

3 讨论与结论

由于同步荧光的光谱比普通荧光谱更为窄化，而且Δλ的选择范围较大，因此，同步荧光法用于荧光物质含量测定时，具有更大的优势。同步荧光法的关键是选择合适的Δλ，而三维同步荧光光谱预先设置扫描间隔，准确地得到最佳Δλ。本研究测定保健食品中维生素B1、B2和B6含量，保健食品中除了三类维生素B与辅料之外，往往还含有其它功效成分，如本实验样品的标识显示还含有烟酰碱、泛酸等成分，因此对同时测定几种维生素B可能产生影响。本研究通过扫描维生素B1、B2和B6三维同步荧光光谱，发现三者的最佳Δλ较接近，选择Δλ=72 nm作为三者的共同同步波长检测三者的含量，Δλ的偏差对三者的影响较小。同时检测维生素B1、B2和B6三者的含量，由于维生素B1需要先在碱性条件下氧化，氧化时间、溶液的酸碱性和反应的时间不仅对维生素B1产生影响，同时也可能对维生素B2和B6有一定的影响，在实验中发现，多次测量样品时产生的偏差偏大。

本研究通过三维同步荧光光谱法同时测定保健食品中维生素B1、B2和B6含量的方法，维生素B1、B2、B6的同步荧光光谱重叠程度较少，最佳Δλ较接近，选择72 nm作为共同同步波长，结果显示样品中含维生素B1、B2和B6分别为2.979 2、2.929 5、2.923 9 mg。本方法简单，准确度高，结果可靠，可同作为同时测定维生素B1、B2和B6含量的方法，但是辅料及其它功效成分的影响还需要进一步研究。