应用基因密码子优化技术建立高效人降钙素原的原核表达方法及产品纯化和鉴定

罗玄梅，黄 薇，孙高远，汤小琨，王璐瑶，邹丽辉

（北京医院 a.国家老年医学中心; b.临床生物样本管理中心，北京 100730）

降钙素原（procalcitonin, PCT）是降钙素的无激素活性前体，大小约13 kDa[1]。PCT浓度可反映炎症的类型及严重程度，在疾病早期诊断及指导抗生素治疗等方面发挥重大作用[2-3]。临床上，PCT检测方法的建立及质量控制均依赖PCT蛋白参考品。然而其多购于国外公司，价格昂贵，且国内外少有报道关于高效制备PCT蛋白参考物质的方法。为此，本文基于密码子优化技术在原核表达系统中高效表达可溶性PCT蛋白，旨在为临床检测提供优质价廉的参考品。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 恒温摇床（苏州培英实验设备有限公司）；电泳仪（Bio-Rad公司）；超声细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；生物梅里埃VIDAS全自动荧光免疫分析仪（法国生物梅里埃公司）；E.coliDH5及E.coliBL21(DE3) pLysS菌株（Takara公司）；pRSF-Duet为笔者实验室保存；BamHI，XhoI和 T4 DNA连 接 酶（Thermo Fisher Scientific公司）；质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒（Axygen Scientific公司）；琼脂粉，卡那霉素抗生素，咪唑，Ni-NTA镍离子亲和树脂及亲和层析柱，IPTG（生工生物工程股份有限公司）；EK酶及卡那霉素抗性的LB培养液为实验室自制。

1.2 方法

1.2.1 优化密码子和合成新基因：从 NCBI数据库检索PCT基因的全长CDS序列，使用E.coliCodon Usage Analyzer 2.1软件分析密码子使用情况，用大肠埃希菌偏好密码子替换稀有密码子，添加6His标签，委托华大基因公司合成。

1.2.2 构建高效表达菌株：将合成序列的BamHI和XhoI双酶切片段插入含麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein, MBP）标签的pRSF-Duet载体。连接产物转入E.coliDH5，接种于卡那霉素抗性的LB培养液。挑选阳性单克隆菌株并提取质粒，经Sanger测序鉴定插入序列及位置。

1.2.3 表达及纯化PCT蛋白：将构建的pMBPPCT-pRSF质粒转入E.coliBL21(DE3) pLysS。取单菌落于LB培养液中37℃ 200r/min过夜培养，按1:500比例接种至500 ml LB培养液，37℃ 200 r/min培养至A600nm=0.4～0.6。加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，20℃ 200 r/min培养16h，诱导目的蛋白表达。离心收集菌体沉淀，重悬于蛋白提取缓 冲 液（50 mmol/L Na3PO4，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑），加入终浓度为1%的Triton-100，冰浴30 min，转移至超声细胞粉碎仪冰浴超声5 min，离心留上清。上清与 Ni-NTA 4℃孵育1h，用咪唑洗脱液（50 mmol/L Na3PO4，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑）洗脱，流出液即为PCT融合蛋白。EK酶去除MBP标签，酶切产物与Ni-NTA 4℃孵育1h，咪唑洗脱液洗脱，流出液即为PCT蛋白。

1.2.4 PCT蛋白浓度检测、稳定性及均匀性评价：采用全自动荧光免疫分析仪及配套试剂检测PCT蛋白浓度。参考CNAS-GL003-2018《能力验证样本均匀性和稳定性评价指南》，于1，2，4，8，16，32，64周，在4℃和-20℃储存的样品总体中随机抽取3份样品检测浓度，评价稳定性。在储存80周的样本总体中，随机抽取10个样品，每个样品平行测定3次，评价均匀性。

1.3 统计学分析 使用SPSS 25.0进行统计分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示。均匀性评价和稳定性评价采用单因素方差分析，计算F统计量，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCT蛋白基因的密码子优化 见图1。用E.coliCodon Usage Analyzer 2.1软件分析发现，在编码PCT蛋白的氨基酸中，24个氨基酸由大肠埃希菌的稀有密码子编码。鉴于稀有密码子会显著降低目的蛋白的表达，故使用偏好密码子替换频率较低的密码子，优化后氨基酸序列与GenBank报道完全一致。

图1 PCT基因密码子优化

2.2 pMBP-PCT-pRSF高效表达载体的构建 见图2。T7启动子控制PCT基因转录，6His及MBP标签分别用于纯化及增强目的蛋白可溶性。阳性单克隆质粒经BamHI和XhoI双酶切，获得大小约450bp的酶切产物，与合成序列的PCR产物大小一致。经NCBI Blastn软件比对，测序结果与预期质粒图谱完全一致，表明pMBP-PCT-pRSF载体构建成功。

图2 构建和验证重组表达载体pMBP-PCT-pRSF

2.3 PCT蛋白的表达分析及纯化鉴定 见图3。第一次亲和纯化产物15g/dl SDS-PAGE电泳图可见大小约60 kDa的蛋白条带，与预期融合蛋白大小一致，条带单一，纯度达95%以上，表明目标MBP-PCT融合蛋白获得了高效表达。使用EK酶处理后，可见 MBP标签被高效切除，获得PCT蛋白。

图3 MBP-PCT蛋白SDS-PAGE电泳图

2.4 PCT蛋白稳定性评价 见表1。纯化所得PCT蛋白浓度达168（168.00±2.65）mg/L。在4℃（F=2.016,P=0.116 4）和-20℃（F=2.620,P=0.052 5）储存期间，组间差异均无统计学意义，表明PCT蛋白适合低温长时间保存。

表1 PCT蛋白不同储存时间稳定性测定结果（±s,mg/L）

表1 PCT蛋白不同储存时间稳定性测定结果（±s,mg/L）

储存温度（℃） 0周 1周 2周 4周 8周 16周 32周 64周4 168.00±2.65 167.67±2.52 166.67±2.52 166.33±1.53 165.00±2.00 164.67±2.08 163.67±3.79 161.00±4.36-20 168.00±2.65 167.67±1.15 167.00±1.00 166.33±0.58 165.67±0.58 165.00±1.00 164.33±1.53 162.67±4.04

2.5 PCT蛋白均匀性评价 见表2。分别从4℃（F=0.727 3,P=0.679 6）和-20℃（F=0.973 9,P=0.489 3）储存的样品总体中随机多次取样检测，PCT蛋白浓度的组间差异无统计学意义，表明均匀性检测合格。

表2 PCT蛋白均匀性测定结果（mg/L）

3 讨论

近年来，PCT作为炎症反应的血清学标志物被广泛应用于临床检测[4]。相较于其他炎症因子，PCT具有较高的特异度和敏感度，在败血症及感染性休克等细菌感染疾病的早期诊断中具有重大意义。PCT蛋白纯品不仅可用作临床检测的参考品，还可用于PCT的实验室相关研究[5]。虽然真核表达系统具有翻译后加工修饰能力，其表达蛋白更接近天然构象，但是成本高和产量低的不足大大限制了该系统的广泛应用。相对而言，本研究采用的原核表达系统成本低廉、操作流程简便快捷，是目前最为广泛应用的蛋白表达体系。

付涛等[6]人研究未考虑不同生物对同义密码子的偏好性，稀有密码子的存在严重影响外源蛋白的表达量[7]。我们利用密码子优化技术，合成PCT蛋白全长密码子优化基因，构建了PCT蛋白高效表达体系。庄锡伟等[8]人研究采用热诱导PCT蛋白的表达，产生了大量包涵体。本研究采用PCT蛋白和MBP助溶蛋白共表达联合低温诱导的方式，克服了常见的包涵体问题，获得了高溶解度的PCT蛋白，MBP融合蛋白的切除可借助位点特异性蛋白酶[9-10]。

本体系大大提升了可溶性PCT蛋白的表达效率和产量，所获得PCT蛋白纯品能够在低温长时间稳定储存且均匀性良好，为临床实验室PCT参考品的研发及PCT蛋白的功能研究奠定了良好基础。