苯丙氨酸羟化酶缺乏症家系PAH基因新发突变分析

马翠霞，封露露，李丽欣，马倩倩，李 扬，封纪珍

(1.石家庄市妇幼保健院 a.遗传科；b.产前诊断科，河北 石家庄 050000；2.石家庄市妇产医院 体检中心，河北 石家庄 050000)

苯丙氨酸羟化酶缺乏和四氢生物蝶呤缺乏都会造成机体苯丙氨酸含量增高，引起高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia，HPA)[1]。有研究显示，我国新生儿疾病筛查中近90%的HPA病因为苯丙氨酸羟化酶缺乏症(phenylalanine hydroxylase deficiency，PAHD)[2]。而PAHD临床表型复杂，新生儿期表现正常，出生后3～4个月皮肤逐渐变白，头发逐渐变黄，汗液、尿液有特殊的鼠臭味，同时也会表现行为、神经异常，对患儿智力造成的损害是永久性的，由于患儿缺乏典型的症状，可能会被误诊为神经系统疾病[3]。PAHD的病因是苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)基因发生突变，且PAH基因突变位点在不同区域、种族间存在明显的差异[4-5]。本研究应用二代测序技术(next generation sequencing, NGS)和多重连接探针技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)对PAHD患儿及其父母基因组进行测序，寻找PAH基因突变位点并进行分析，旨在为PAHD家庭的遗传咨询提供有效的依据。

1 资料与方法

1.1病例选择 此PAHD家系由石家庄市新生儿疾病筛查诊治分中心收集，共3名成员，先证者为女性，确诊时出生45天，家系情况见图1。本研究经医院伦理委员会批准，所有受试对象均签署了相关的知情同意书。

图1 PAHD家系图

1.2基因测序

1.2.1提取DNA 使用德国Qiagen试剂盒提取受检者静脉血中DNA，并且使用Nanodrop 2000分光光度计进行质检，若DNA质量等级为D级则不合格，不能进行基因组文库构建。鉴定按照以下标准：①DNA浓度≥30 ng/μl时，1.7≤OD260/280吸收的比值(a)<2.0，质量等级为A级；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3，质量等级为B级；a<1.5或a>2.3，质量等级为C级。②20 μg/ml≤DNA浓度<30 μg/ml 时，1.7≤a<2.0，质量等级为B级；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3，质量等级为C级；a<1.5或a>2.3，质量等级为D级。③DNA浓度<20 μg/ml 时，质量等级均为D级。

1.2.2构建文库 采用Covaris打断法将检测样本打碎为小分子片段(100～700 bp)，将小片段DNA末端进行加“A”修复，并对产物进行纯化。配置反应体系，充分混匀离心后98 ℃预变性1个循环2 min，98 ℃变性8个循环30 s，65 ℃退火8个循环30 s，72 ℃延伸8个循环30 s，最后72 ℃延伸1个循环5 min。对扩增产物进行纯化质检，若DNA质量等级为D级则不合格，不能进行下一步。鉴定按照以下标准：①DNA浓度≥50 μg/ml 时，1.7≤a<2.0，质量等级为A级；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3，质量等级为B级；a<1.5或a>2.3，质量等级为C级。②30 μg/ml ≤DNA浓度<50 μg/ml 时，1.7≤a<2.0，质量等级为B级；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3，质量等级为C级；a<1.5或者a>2.3，质量等级为D级。③DNA浓度<30 μg/ml 时，质量等级为D级。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳于200～500 bp处呈现清晰条带则建库成功。

1.2.3捕获目的区域 标记生物素的探针与文库DNA杂交，60 ℃孵育16 h以上，杂交后的探针共价结合链霉亲和素修饰的磁珠，磁珠及携带的目的基因经过磁力架的吸附作用达到洗脱纯化富集目的基因的目的。

1.2.4上机测序 采用“桥式”扩增反应，NextSeq 500对加载到Flowcell测序芯片上的文库自动循环，采用末端可逆边合成边测序的方式，并对不同标记的核苷酸测序，根据标记的不同荧光信号确认碱基种类，经过数个循环后读取完整的核酸序列，最终保证核酸序列质量。

1.2.5生物信息分析 统计读取次数数量和测序质量，将处理后的数据与人基因组(hg19)进行排序、比对、过滤，去除冗余读取次数，降低假阳性。对插入缺失标记(Indel)附件中读取次数重新比对，消除周边假阳性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。通过重新计算碱基质量值，对碱基进行纠正，之后将SNP和Indel结果关联到多个数据库，进行注释、解析。

1.2.6基因突变位点生物信息分析 根据美国医学遗传学与基因组学学会(America College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南对基因测序检测到的突变位点进行致病性分析，对于未报道的位点，使用SIFT、PolyPhen_2、REVEL等软件进行生物信息预测。

1.3MLPA 使用DNA提取试剂盒提取受试者核酸，并对提取的DNA进行质检，若DNA质量等级为D级则不合格，不能进行下一步。鉴定按照以下标准：①DNA浓度≥30 μg/ml时，1.7≤OD260/280吸收的比值(a)≤2.0及2.02.3及1.0≤b≤2.0，质量等级为C级。②21 μg/ml≤DNA浓度<30 μg/ml时，1.7≤a≤2.0及1.0≤b≤2.0，质量等级为B级；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3及1.0≤b≤2.0，质量等级为C级；a<1.5或a>2.3及b<1.0，质量等级为D级。③DNA浓度≤20 μg/ml时，质量等级均为D级。DNA质检符合要求后变性，加入探针混合液和MLPA缓冲液，孵育杂交。产物与连接酶混合液孵育连接，加热使酶失活。然后加入引物、dNTP和DNA聚合酶进行反应，最终将扩增片段长度和结果峰导入软件并分析结果。

2 结 果

2.1PAH基因测序 先证者PAH基因测序结果显示：第6外显子c.630T>G和第2外显子c.61-1G>A。其中c.630T>G为错义突变，这一突变使PAH基因第210号所编码的氨基酸发生改变，苯丙氨酸变为亮氨酸 (p.F210L)；c.61-1G>A为剪接突变。这两个突变位点在正常人群数据库为低频变异，在人类基因突变数据库(Human Gene Mutation Database, HGMD)中未见报道，见图2～3。

图2 PAHD患儿PAH基因外显子6中c.630T>G错义突变(箭头处为基因突变位置)

图3 PAHD患儿PAH基因外显子2中c.61-1G>A剪接突变(箭头处为基因突变位置)

2.2生物信息及致病性分析 使用软件SIFT、PolyPhen_2、REVEL对c.630T>G进行预测分析，分别为良性、有害、有害；对c.61-1G>A进行预测分析，分别为未知、未知、未知。C.630T>G为错义突变，Sanger验证家系分析显示，先证者之父此位点杂合变异，其母无变异，ACMG指南初步判定其为临床意义未明突变。c.61-1G>A为剪接突变，家系分析显示先证者之父此位点无变异，其母杂合变异，ACMG指南初步判定其突变为疑似致病性突变。

2.3氨基酸的保守性分析及蛋白质的三维结构预测 通过模式生物保守性分析，PAH基因第210号编码的苯丙氨酸在人、黑猩猩、猕猴、家犬、黄牛、小白鼠、褐家鼠、鸡、斑马鱼、果蝇、冈比亚按蚊、秀丽隐杆线虫、热带爪蟾中高度保守，见图4。蛋白质三维分子结构预测PAH基因突变型NM＿000277 c.630T>G(p.F210L)第210号氨基酸附近氢键明显减少，由苯丙氨酸变为亮氨酸，见图5。

图4 不同物种中PAH基因第210号编码的苯丙氨酸位点保守性

图5 PAH基因蛋白三维分子结构预测分析 a.野生型PAHp.F210L; b.突变型PAHp.F210L

2.4MLPA结果 MLPA检测电泳峰图显示先证者的PAH基因外显子未发现拷贝数异常，见图6。

图6 MLPA检测电泳峰图 a.对照样本；b.先证者

3 讨 论

HPA是苯丙氨酸在代谢过程中PAH或其辅酶缺乏造成苯丙氨酸增高的一种代谢性疾病。随着筛查技术的不断提高，PAHD患儿的诊断由临床症状逐步转变为生物化学及基因诊断，其中基因诊断是HPA的确诊方法。PAHD具有复杂的临床表型，迄今为止，国际上已经报告多达1 000种PAH基因突变类型，在我国人群中有100余种[6-7]。不同地区、不同人群中PAHD的发病率和突变位点均有很大差异[8]，我国也是如此，不同地区、人群的基因突变需要进一步验证[9-11]。有研究显示，我国北方汉族人群PAH基因突变的情况与其他民族存在差异[12]，突变位点在不同地区中也有所不同。青岛PAH基因的突变热点主要为c.728G>A、c.1068C>A、c.158G>A[13]；郑州主要为c.728G>A、c.331C>T、c.611A>G[14]；唐山主要为c.728G>A、c.331C>T、c.782G>A[15]；而在我国南方一些地区，如安徽PAH基因的突变热点主要为c.728G>A、c.158G>A、c.611A>G[16]，四川主要为c.728G>A、c.721C>T、c.611A>G[17]，以上分析结果显示各个地区PAH基因突变位点不完全相同但又存在一定的联系。

本研究PAHD患儿的突变方式为错义突变和剪接突变，突变位点在第6外显子和第2外显子：630号核苷酸由胸腺嘧啶变为鸟嘌呤(c.630T>G)的错义突变，使第210号氨基酸发生明显的改变。ACMG 指南对此突变判定为临床意义未明，在ESP、EXAC和千人数据库正常对照人群中未发现的变异。通过对先证者父母验证，发现在PAH基因反式位置检测到致病突变。先证者表型与单基因遗传病高度符合，采用SIFT、PolyPhen_2、Mutation Taster软件分析该突变位点位于PAH蛋白的高度保守区，氨基酸的变化导致蛋白质功能发生改变从而致病，预测软件REVEL预测此突变有害，HGMD数据库没有相关报道。c.61-1G>A为零效变异，导致氨基酸发生明显改变，ACMG指南判定为疑似致病性变异，这一突变可能导致基因功能丧失，在ESP、EXAC和千人数据库正常对照人群中未发现此变异；软件REVEL预测为未知，HGMD数据库没有相关报道。c.61-1G>A的剪接突变因外显子剪接位点发生改变使对应的外显子缩短、丢失，SIFT、PolyPhen_2和REVEL蛋白功能预测软件对此剪接突变预测结果均为未知，然而这一突变对人体的影响仍需要进一步的研究、分析、确认[18]。第6外显子编码的氨基酸位于蛋白质的活性中心，所以这个区域发生大片段缺失时会严重影响酶的活性，然而发生片段缺失的患儿较少，需要扩大样本量进行深入研究[19]。

对基因功能改变影响较大的突变有致病突变，反之为沉默突变。致病突变能够严重影响基因编码的氨基酸生物合成各个环节以及蛋白质的结构，进一步对PAH催化活性产生影响。而发生沉默突变的基因碱基发生的改变可能使氨基酸发生改变，但不会影响蛋白质的活性和功能。NGS能够检测点突变和小片段缺失、插入，而MLPA虽然不适用于检测未知点突变，但对缺失的大片段、重排能够很好的检出，这两种技术联合使用可有效提高检测准确率。

疾病相关基因测序发现，本研究PAHD患儿存在与疾病表型相关的疑似致病性突变，经基因测序确诊为PAHD，血苯丙氨酸浓度为2.4 mg/dl，诊断为轻度HPA，定期监测苯丙氨酸浓度，最高为4.2 mg/dl。《高苯丙氨酸血症的诊治共识》[20]指出，轻型HPA的治疗可以暂缓，但是要定期监测血苯丙氨酸浓度，如果两次连续血苯丙氨酸浓度>6.0 mg/dl(360 μmol/L)，应进行低苯丙氨酸治疗，治疗后3～6个月对患儿进行生长发育评估，1岁、2岁、3岁、6岁时进行智能发育评估，使其体格、智力接近或达到正常儿童的发育水平。在患儿感染一些疾病，如脓毒血症、创伤和慢性肾功能衰竭时，需要严密监测血苯丙氨酸浓度，可根据血苯丙氨酸浓度调整临床治疗方案[20]。如果后期对患儿进行治疗，尤其需要注意避免过度治疗造成苯丙氨酸缺乏。苯丙氨酸作为人体必需的一种氨基酸，如果缺乏会造成皮肤损害、营养不良、低蛋白血症等，甚至危及生命[21]。通过早期筛查、规范治疗，可以使患儿发育达到或接近正常儿童的水平。

本研究阐明了一个轻度HPA家系的未报道致病基因突变，扩大了石家庄市苯丙酮尿症尤其是轻度HPA患儿PAH基因的突变谱，对了解该病的发生、发展以及患儿家庭的遗传咨询提供有力的支持，对于c.61-1G>A影响PAH基因的作用机制也需要深入的研究。