HPLC 法测定对乙酰氨基酚原料药有关物质及遗传毒性杂质

赵淑晶，高永坚，区淑蕴，刘勇，梁凤友，肖艳

（国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528303）

对乙酰氨基酚为乙酰苯胺类解热镇痛药，具有良好的解热、镇痛作用，在世界上广泛应用。分析各国药典质量标准及对乙酰氨基酚原料的合成工艺确认已知杂质共有15 个（见表1），其中对氯苯乙酰胺（杂质J）和对氨基酚（杂质K）为已列入《中国药典》（ChP2020）、《英国药典》（BP2022）、《美国药典》（USP43）标准的杂质，杂质A、杂质B、杂质D为已列入《美国药典》（USP43）标准的杂质；另参考文献[2-3]可知：杂质C、杂质E、杂质G 和杂质I 是以对羟基苯乙酮为原料合成对乙酰氨基酚的过程中产生的杂质，杂质H、杂质L、杂质M、杂质N、杂质F、杂质O均为以对氨基酚为原料合成对乙酰氨基酚的过程中引入的工艺杂质。

表1 对乙酰氨基酚原料中已知杂质Table 1 Known impurities in Acetaminophen API

通过查询致癌性数据库（carcinogenicity potency database,CPDB）及文献[4-5]，确定对硝基氯苯（杂质O）和对硝基苯酚（杂质F）为遗传毒性杂质。根据2020 年版《中国药典》四部通则9306 遗传毒性杂质控制指导原则、国际人用药品注册技术协调会（ICH）M7（R1）和Q3D指导原则，对乙酰氨基酚每天总剂量不超过2 g，对硝基氯苯限度按473 mg/（kg·d）计算（CPDB），限度要求为0.02%，对硝基苯酚限度按13.8 mg/（kg·d）计算(未观察到作用剂量，noobserved effect level,NOEL[4]），限度要求为0.06%。

目前，尚未有同时检测对乙酰氨基酚原料多种有关物质及遗传毒性杂质的文献报道。本研究建立了对乙酰氨基酚原料中有关物质及遗传毒性杂质的测定方法，对其中9 个已知杂质（杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质H、杂质J、杂质K、杂质O）进行测定，为本品质量控制提供参考。

1 仪器与试药

LC-20A、LC-2010A 型高效液相色谱仪（岛津科技有限公司）；色谱柱：SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×200 mm，5 µm，依利特）、Ultimate AQ-C18（4.6 mm×200 mm，5µm，月旭）。

对乙酰氨基酚原料药[河北冀衡（集团）药业有限公司，批号011805003、011806176、011806177；对乙酰氨基酚（批号100018-201610）、对氨基酚（批号100802-201604）、对氯苯乙酰胺（批号100850-201803）来自中国食品药品检定研究院；杂质A（批号8-ANR-29-1）、杂质C（批号5-SCC-154-1）、杂质H（批号7-ABY-121-1）、对硝基苯酚（批号11-MWC-191-1）来自Toronto Research Chemicals（TRC）；杂质B（批号20-HPE-04Y3）、杂质D（批号38-END-12Y3）来自STC Research Chemicals Ltd；对硝基氯苯（批号H1313034）来自阿拉丁。甲醇为色谱纯，醋酸铵为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品储备液的制备 精密称取对乙酰氨基酚对照品适量，用40%（体积分数，下同）甲醇制成对乙酰氨基酚储备液（54.3µg/mL）。

精密称取对氨基酚对照品适量，用40%甲醇制成对氨基酚储备液①（541µg/mL）；精密量取2 mL，置200 mL 量瓶中，用40%甲醇稀释制成对氨基酚储备液②（5.41µg/mL）。

精密称取对氯苯乙酰胺对照品适量，用甲醇制成对氯苯乙酰胺储备液①（208.2µg/mL）；精密量取1 mL，置200 mL 量瓶中，用40%甲醇稀释制成对氯苯乙酰胺储备液②（1.041µg/mL）。

精密称取对硝基氯苯对照品适量，用甲醇制成对硝基氯苯储备液①（454.3µg/mL）；精密量取1 mL，置10 mL 量瓶中，用40%甲醇稀释制成对硝基氯苯储备液②（45.4µg/mL）。

精密称取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质H、对硝基苯酚对照品适量，用40%甲醇制成含杂质A（100.4 µg/mL）、杂质B（104.5 µg/mL）、杂质C（109.4 µg/mL）、杂 质D（106.6 µg/mL）、杂 质H（113.6 µg/mL）和对硝基苯酚（133.2 µg/mL）的混合对照品储备液。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密量取对乙酰氨基酚对照品储备液2 mL、混合对照品储备液1 mL、对硝基氯苯储备液②1 mL、对氨基酚储备液②2 mL、对氯苯乙酰胺储备液②2 mL，置10 mL 量瓶中，用40%甲醇制成约含对乙酰氨基酚10 µg/mL、杂质A 10µg/mL、杂质B 10µg/mL、杂质C 10µg/mL、杂质D 10µg/mL、杂质H 10µg/mL和对硝基苯酚12µg/mL、对硝基氯苯4 µg/mL、对氨基酚1 µg/mL、对氯苯乙酰胺0.2µg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取对乙酰氨基酚原料药适量，精密称定，加40%甲醇溶解并定量稀释制成每1 mL中约含20 mg的溶液。

2.1.4 对照品溶液的制备 精密量取供试品溶液1 mL，置20 mL 量瓶中，用40%甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液1 mL，置20 mL 量瓶中，用40%甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.2 色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（4.6 mm×200 mm,5µm）；检测波长为245 nm，柱温为35 ℃。以0.05 mol/L 醋酸铵为流动相A，甲醇为流动相B，流速1.0 mL/min，按表2进行梯度洗脱，进样量20 μL。

表2 流动相洗脱梯度Table 2 Mobile phase elution gradient

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验 取“2.1.2”项混合对照品溶液作为系统适用性试验溶液，按“2.2”项色谱条件进样分析，结果见图1 及表3。可见，各杂质与主成分（对乙酰氨基酚）的分离度以及各杂质间的分离度均大于1.5，表明该色谱条件专属性良好。

表3 对乙酰氨基酚与各杂质的保留时间和分离度Table 3 Retention time and separation of acetaminophen and impurities

图1 系统适用性试验色谱图Figure 1 Chromatogram of system suitability test

2.3.2 耐用性试验 在选定的色谱条件下，微小改变流动相比例（醋酸铵浓度0.04～0.06 mol/L）、流速（0.8～1.2 mL/min）、柱温（30～40 ℃）及选用同规格型号但不同批号的依利特（E2917651、E3020745）、不同品牌（月旭，221701657）色谱柱后，分别取“2.1.2”项混合对照品溶液进行试验，结果显示：不同条件下，各杂质与主成分（对乙酰氨基酚）的分离度以及各杂质间的分离度均大于1.5，表明选定的色谱条件耐用性良好。

2.3.3 线性范围 精密称取对氯苯乙酰胺、对硝基氯苯对照品适量，分别用甲醇制成对氯苯乙酰胺储备液（233.6µg/mL）、对硝基氯苯储备液（454.3µg/mL）；另精密称取对乙酰氨基酚、对氨基酚、对硝基苯酚对照品适量，用40%甲醇制成乙酰氨基酚储备液（52.3 µg/mL）、对氨基酚储备液（549.5 µg/mL）、对硝基苯酚储备液（125.1µg/mL），上述储备液用40%甲醇稀释制成一系列浓度溶液，按“2.2”项色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性回归，结果见表4。

表4 线性范围试验结果Table 4 Results of linear range

2.3.4 检出限和定量限试验 取“2.1.1”和“2.3.3”项下对照储备液适量，用40%甲醇逐级稀释，依法测定，以信噪比为3∶1时计算检测限，以信噪比为10∶1时计算定量限，结果详见表5。

表5 检出限和定量限试验结果Table 5 Results of detection limit and quantitation limit

2.3.5 精密度试验 取“2.1.2”项混合对照品溶液按“2.2”项色谱条件连续进样测定6 次，以峰面积计算RSD，结果在0.1%～8.1%之间，小于10%，表明方法精密度良好，见表6。

2.3.6 稳定性试验 参照“2.1.2”项混合对照品溶液配制方法，配制除对乙酰氨基酚外的杂质混合对照溶液，分别置于室温（10～30 ℃）和冰箱（4～6 ℃）中，室温于0、4、8、12、24 h 时取样，冰箱于0、17、40、78 h时取样，依法测定，计算峰面积RSD，结果显示，除在室温、24 h 和冰箱、78 h 时，对氨基酚和对硝基氯苯的峰面积RSD 值大于2%外，其他杂质对照RSD值均小于2%，见表7。

取一批次样品（批号011912026），按“2.1.3”项配制供试品溶液，“2.1.4”项配制对照溶液，并按“2.2”项色谱条件进样分析，供试品溶液在室温、24 h及冰箱、78 h内各时间点杂质含量与0 h比较。外标法计算对氨基酚、对氯苯乙酰胺、对硝基苯酚、对硝基氯苯，均未检出；不加校正因子的主成分自身对照法计算其他杂质，最大单杂和总杂含量变化的绝对值小于0.02%，表明溶液稳定。

2.3.7 重复性试验 取一批次样品（批号011912026），按“2.1.3”项供试品溶液和“2.1.4”项对照溶液方法制备，平行6 份，并按“2.2”项色谱条件进样测定；由不同的分析人员，使用不同的仪器和不同批号的色谱柱在不同日期进行另外6 份供试品溶液测定，综合12 次测定结果，均未检出对氨基酚、对氯苯乙酰胺、对硝基苯酚和对硝基氯苯，最大单杂和总杂含量变化的绝对值小于0.02%，表明方法重复性良好。

2.3.8 回收率试验 精密称取9 份对乙酰氨基酚原料药（批号011912026）0.4 g，分别精密加入“2.3.3”项对照品溶液适量，按“2.1.3”项方法制备供试品溶液9 份，按“2.2”项色谱条件进样分析，根据“2.3.3”项下的线性回归方程计算各浓度准确度溶液的测定得量，计算回收率，结果见表8。

表8 回收率试验结果Table 8 Results of recoveries

2.4 样品的测定

取3 批对乙酰氨基酚原料（批号：011805003、011806176、011806177）依法制备供试品溶液和对照品溶液，按“2.2”项色谱条件进样分析，结果显示：3批原料中对氯苯乙酰胺的检测结果分别为未检出、0.001%、0.001%；对氨基酚的检测结果分别为未检出、未检出、0.001%；其他单杂的检测结果分别为0.02%、0.02%、0.02%；总杂的检测结果分别0.04%、0.03%、0.03%；3批均未检测出对硝基氯苯（检测限：0.061 μg/mL）和对硝基苯酚（检测限：0.053 μg/mL）。

3 讨论

3.1 方法的优化

对比各国药典收载的对乙酰氨基酚原料有关物质检测方法，ChP2020 和USP43 均需使用2 个液相方法测定有关物质，BP2022 虽然只使用1 个液相方法检测，但只检测了对氨基酚和对氯苯乙酰胺，其他特定杂质的检出能力未知，且规定的C18柱（100 mm×2.1 mm, 2.7 μm）一般要使用超高效液相测定，普通液相不适用。而本研究建立的方法可以使用普通液相同时检测9 种已知杂质，方法简便快捷，检验效率高，推广性好。

3.2 特定杂质的确定

比较各国药典中收载的对乙酰氨基酚原料药的质量标准，对于已知杂质，除USP43规定了5种杂质的限度外，ChP2020、BP2022 均只规定了对氨基酚、对氯苯乙酰胺的限度。本研究建立的方法可以同时检测9 种已知杂质，但从节约检验成本角度出发，建议日常检验将对氨基酚、对氯苯乙酰胺作为特定杂质控制，其他杂质作为未知单杂控制。另外，为确保产品的安全性，建议增加对遗传毒性杂质（对硝基苯酚、对硝基氯苯）的控制。

3.3 杂质限度的确定

参考各国药典中收录的杂质及限度，并遵循从严原则，暂定普通杂质限度标准：按外标法以峰面积计算，对氨基酚不得过0.005% ，对氯苯乙酰胺不得过0.001%；不加校正因子的主成分自身对照法计算其他单个杂质，不得过0.05%；各杂质之和（即总杂）不得超过0.1%。另针对遗传毒性杂质，结合前面计算的限度要求，建议设定限度标准：按外标法以峰面积计算，对硝基氯苯不得过0.02%；对硝基苯酚不得过0.06%。

本研究建立的方法能同时检测对乙酰氨基酚原料中有关物质（对氨基酚、对氯苯乙酰胺、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质H）及遗传毒性杂质（对硝基苯酚、对硝基氯苯）的含量，线性关系与精密度均良好，方法准确度高，检测下限与定量下限能满足分析要求，此方法弥补了药典中原料有关物质检测项的不足，确保了产品的安全性。