HPLC法测定阿伐那非对映异构体的研究

刘元芬，叶星辰，王纠

（1.江苏卫生健康职业学院，江苏 南京 211800；2.广东省药物新剂型重点实验室，广东 广州 510006；3.广东药科大学新药研发中心，广东 广州 510006；4.广东省药物缓控释制剂工程技术研究中心，广东 广州 510006；5.广东省局部精准药物递药制剂工程技术研究中心，广东 广州 510006）

阿伐那非（avanafil）是一种口服速效的高选择性磷酸二酯酶5（PDE5）抑制剂，能抑制环磷酸鸟苷在体内的代谢，从而使平滑肌的舒张作用得以加强，阴茎的血流量增加，进而帮助勃起，用于治疗男性勃起功能障碍（ED）[1-3]。阿伐那非具有与其他PDE5 抑制剂相同的作用机制，但口服吸收更快，大多数ED患者在使用本品后0.5 h内即能成功进行性生活，等效或优于目前市场上的其他PDE5 抑制剂[4]，如西地那非（商品名：伟哥）、伐地那非（商品名：艾力达）、他达拉非（商品名：西力士）等。美国FDA 于2012 年4月批准阿伐那非上市，并于2013年由Vivus 授权Auxilium 在美国进行销售，商品名为Stendra[5]。

阿伐那非原研药（C23H26ClN7O3）结构为(S)-4-[(3-氯-4-甲氧基苄基)氨基]-2-[2-(羟甲基)-1-吡咯烷基]-N-(2-嘧啶基甲基)-5-嘧啶甲磺酰胺。阿伐那非在合成过程中引入L-脯胺醇手性分子，得到中间体4-[（3-氯-4-甲氧基苯基）甲氨基]-2-[（S）-2-羟甲基吡咯-1-基]嘧啶-5-羧酸乙酯（中间体3，图1），因此在结构中具有一个手性分子中心，构型为S型，其结构和R型对映异构体结构见图2[6-8]。

图1 阿伐那非手性结构的产生Figure 1 Formation of avanafil isomers

图2 阿伐那非（A）与阿伐那非对映异构体（B）的化学结构式Figure 2 The chemical structure of S-avanafil(A)and R-avanafil(B)

阿伐那非对映异构体虽然与阿伐那非分子式相同，但S型是活性成分，R型对映异构体却是合成中的杂质。目前，关于阿伐那非的含量测定方法已有文献报道[9-13]，但未见有采用HPLC 法测定阿伐那非对映异构体的报道，因此，本文拟建立HPLC法对阿伐那非对映异构体进行测定，为阿伐那非仿制药的质量标准研究和上市研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Agilent g1314A VWD 检测器（美国安捷伦公司）；CHIRALCEL OD-H 色谱柱（日本DAICEL 大赛璐公司，Lot:No.ODH0CE-PH042,5 μm,4.6 mm×250 mm）；ME104 电子分析天平（瑞士梅特勒，十万分之一）。

1.2 材料

乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；正己烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；L-脯胺醇（分析纯，泰州精英化成医药科技有限公司）；水为娃哈哈纯净水；阿伐那非对照品（批号：20180802，供含量测定用）、阿伐那非对映异构体对照品（批号：20181029，供含量测定用）和阿伐那非样品（批号20180804、20180806、20180808、20180810、20180813、20180815）均为自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent 1100 高效液相色谱仪；Agilent g1314A VWD 检 测 器；Agilent Chemstation 色 谱 工 作 站；CHIRALCEL OD-H 色谱柱；流动相：正己烷-乙醇（体积比82∶18）；检测波长：233 nm；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

阿伐那非供试品溶液：取制备的阿伐那非原料药适量，精密称定，加无水乙醇溶解并稀释制成每1 mL约含阿伐那非400 μg的溶液。

阿伐那非对映异构体对照品储备液A：取阿伐那非对映异构体对照品适量，精密称定，加无水乙醇溶解并稀释制成每1 mL 约含阿伐那非対映异构体400 μg的溶液。

阿伐那非对映异构体对照品溶液：取阿伐那非对映异构体对照品储备液A 0.5 mL，置100 mL量瓶中，加无水乙醇稀释制成每1 mL约含阿伐那非对映异构体2 μg的溶液。

系统适用性溶液：精密称取阿伐那非和阿伐那非对映异构体适量，置同一容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释制成每1 mL约含阿伐那非400 μg、阿伐那非对映异构体2 μg的混合溶液。

阿伐那非对映异构体专属性试验溶液：取阿伐那非对映异构体对照品储备液A 1.0 mL，置100 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至含阿伐那非对映异构体4 μg/mL。

2.3 专属性试验

精密吸取空白溶液、阿伐那非对映异构体专属性试验溶液和系统适用性溶液各20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图3。可见，阿伐那非对映异构体和阿伐那非的保留时间分别为24.32 min和21.14 min，两者达到有效分离，分离度为2.4，理论塔板数为4745，表明方法专属性好。

图3 阿伐那非异构体专属性试验图谱Figure 3 Chromatogram of specificity test

2.4 耐用性试验

分别考察流动相比例、流速、波长和柱温等因素以调整色谱条件，精密量取阿伐那非供试品溶液和系统适用性溶液各20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，考察异构体分离情况，结果见表1。可见，对原色谱条件中的波长、柱温、流速及流动相比例在一定范围内进行调整，系统适用性溶液中对映异构体与阿伐那非主成分色谱峰间的分离无明显差异，分离度大于1.5，溶液中对映异构体检测质量分数约为0.42%；阿伐那非供试品溶液中均未检出对映异构体，杂质检出无明显差异。

表1 耐用性试验结果Table 1 Results of durability test

2.5 定量限和检测限的测定

阿伐那非对映异构体的检测限（LOD）和定量限（LOQ）按“2.1”项下色谱条件，根据信噪比法确定。用无水乙醇逐级稀释成不同浓度进行测定，当峰面积为9.67，其信噪比为10 左右，这时计算的浓度即为最低定量限浓度，当信噪比为3 左右时即为最低检测限浓度。结果测得阿伐那非对映异构体的定量限为0.10 μg/mL，检测限为0.033 μg/mL。

2.6 线性关系考察

精密称取阿伐那非及其对映异构体各约10 mg，分别置2个20 mL量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密移取1.0 mL，置同一50 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液储备液。分别精密移取0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0、4.0、6.0 mL 置9 个10 mL 量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性关系考察溶液。

按“2.1”项下色谱条件，精密量取各线性溶液20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，以质量浓度为横坐标、以峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程并绘制标准曲线。结果显示，阿伐那非质量浓度在0.10～6.05 μg/mL 范围内与峰面积成线性相关，线性方程为Y=76.757X+2.8889，r=0.9999；阿伐那非对映异构体质量浓度在0.10～6.03 μg/mL 范围内与峰面积成线性相关，线性方程为Y=77.23X+2.592，r=0.9999。线性方程截距均小于100%响应值的20%，响应因子RSD 值小于10%，表明线性关系良好，符合试验要求。

2.7 稳定性试验

按“2.1”项色谱条件，分别于0、1、2、4、8、12、24 h精密量取阿伐那非供试品溶液及阿伐那非对映异构体对照品溶液各20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，考察供试品溶液及异构体溶液的稳定性。结果显示，阿伐那非供试品溶液室温下放置24 h，主峰峰面积未见明显减小，峰面积RSD值为0.32%，同时未检出阿伐那非对映异构体；阿伐那非对映异构体溶液室温放置24 h，主峰峰面积未见明显减小，峰面积RSD值为0.42%，表明在该检测色谱条件下，阿伐那非及其对映异构体溶液室温条件下24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验和精密度试验

精密吸取阿伐那非对映异构体对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，连续进样6 针，测定峰面积平均值及计算RSD 值，结果显示峰面积平均值为32.97，RSD 值为1.9%，表明方法重现性良好。

为了考察随机变动的因素对精密度的影响，中间精密度试验由甲、乙两人分别独立建立系统，使用同品牌不同的仪器，在不同的日期，按“2.1”项下色谱条件测定同一批阿伐那非对映异构体对照品溶液浓度，结果测得峰面积RSD 值均低于1%，表明方法中间精密度较好。

2.9 回收率试验

精密称取阿伐那非对映异构体对照品，依法配置成质量浓度约为0.5 mg/mL 的标准母液，然后分别精密移取该标准母液0.32、0.40、0.48 mL 置100 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，作为回收率试验80%（低）、100%（中）及120%（高）溶液。称取阿伐那非对照品约10 mg，置25 mL 量瓶中，平行称取9 份，分别用上述回收率低、中、高溶液溶解并稀释至刻度，每个浓度平行配制3份，分别精密量取20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，代入标准曲线方程按外标法计算回收率。结果见表2。可见，低、中、高质量浓度的阿伐那非对映异构体溶液的回收率在97.21%～100.41%范围内，RSD均小于1.0%，表明方法准确度较好，符合方法学考察要求。

表2 阿伐那非对映异构体回收率试验结果Table 2 Results of recovery test of avanafil isomer

2.10 自制样品中对映异构体的测定

取6 批样品（20180804、20180806、20180808、20180810、20180813、20180815），按“2.2”项方法配制阿伐那非供试品溶液，精密量取20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。由于阿伐那非异构体的含量低于检测限，6批样品均未检测出对映异构体。

3 讨论

3.1 最大吸收波长的选择

阿伐那非和阿伐那非对映异构体以正己烷-乙醇（体积比82∶18）为溶剂，在200～400 nm 波长范围进行紫外扫描，结果显示阿伐那非对映异构体在233 nm 波长处有最大吸收，阿伐那非在236、266、310 nm 波长处有最大吸收。因此，确定233 nm 为检测波长。

3.2 对映异构体旋光性的测定

阿伐那非为S型异构体，其对映异构体为R 型。经检测阿伐那非的旋光度为-78～-84º，阿伐那非对映异构体旋光度为78～84º。少量对映异构体对旋光度的影响不显著，对阿伐那非质量控制时，在其旋光度检测合格后再通过HPLC 法进行检测，可以更加准确地控制阿伐那非对映异构体的量。

对映体具有相同的物理性质（如熔点、沸点、溶解度）、热力学性质（如自由能、焓、熵）和化学性质等，但它们对偏振光的作用不同（比旋光度数值相同，方向相反）、对生物体的活性不同。虽然目前尚缺乏阿伐那非对映异构体杂质的毒性和活性试验研究报道，很多杂质分析试验也并未将阿伐那非对映异构体列为杂质项进行分析，但是二者在活性、药理学、药动学和毒理学方面可能存在差异，临床一般以单一对映体给药，因此对阿伐那非对映异构体杂质进行质量控制，可以提高药品阿伐那非的质量纯度和疗效。

本文采用手性柱HPLC法检测阿伐那非对映异构体，结果显示该方法测定阿伐那非对映异构体精密度、准确度高，在0.10～6.03 μg/mL 质量浓度范围内线性良好，同时方法检测限和定量限均能满足测定要求，表明该方法是一种简单、快速测定阿伐那非对映异构体的分析方法，适应于阿伐那非异构体的检测和限度控制。