芦荟大黄素通过EGF/EGFR/HER2信号通路对乳腺癌内分泌耐药的作用

孙星，赵得堡，刘越，刘扬帆，盛晶，刘丽娜，屈中玉，万里新，李刚

（1.南阳市中心医院肿瘤内科，河南 南阳 473000；2.南阳市第二人民医院肿瘤内科，河南 南阳 473009）

乳腺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，根据基因的临床分型包括多种亚型，其中多数是雌激素受体阳性患者[1]。内分泌治疗是激素依赖性乳腺癌的重要治疗手段，他莫西芬（tamxifen,TAM）是一种雌激素受体的竞争性抑制剂，常用于乳腺癌内分泌治疗，它可通过与雌激素竞争性结合雌激素受体，阻碍雌激素的生物学活性，对雌激素受体阳性乳腺癌患者具有疗效，但癌细胞获得耐药性常导致治疗效果欠佳，因此解决内分泌耐药是治疗乳腺癌的关键[2]。芦荟大黄素是一种提取于芦荟的蒽醌类化合物，具有抗肿瘤活性。研究发现，芦荟大黄素能增强乳腺癌细胞对顺铂的敏感性，降低癌细胞增殖、迁移和侵袭能力[3]。此外，芦荟大黄素通过诱导癌细胞凋亡，对宫颈癌Hela 细胞具有放射增敏作用[4]。表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）与其特异性受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）结合激活一系列信号转导通路，对细胞增殖和分化起到重要作用。人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）在正常组织中表达较低，其与EGF 受体家族的成员结合及配体形成复合物后参与细胞增殖信号的转导[5]。本研究以耐药细胞MCF-7/TAM 为研究对象，探讨芦荟大黄素是否能通过EGF/EGFR/HER2 信号通路逆转MCF-7/TAM耐药性。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人乳腺癌MCF-7细胞株购自美国ATCC公司。

1.2 试剂和仪器

芦荟大黄素（质量分数≥80%）购自南京泽朗生物科技有限公司（批号：481-72-1）；TAM购自美国Sigma公司（批号：T5648-5G）；细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD 公司（批号：556507）；兔抗人HER2、EGF、p-EGFR、EGFR、B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lym‐phoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体购自美国Abcam公司（批号分别为ab134182、ab206106、ab97613、ab52894、ab32124、ab243140）；胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司（批号：16000-044、25200-056）；山羊抗兔二抗购自美国Abcam 公司（批号：ab97051）；SynergyHTX 多功能酶标仪购自美国Bio-Tek 公司；CytoFLEX 流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。

1.3 建立TAM耐药细胞株[6]（MCF-7/TAMR）

将MCF-7 细胞培养于含10%（φ）胎牛血清的DMEM培养基中，取对数生长期的MCF-7细胞制成单细胞悬液，接种于培养皿，更换为含1×10-6mol/L的TAM、5%胎牛血清的DMEM 培养基培养21 d，收集细胞，将细胞在无TAM 的培养基中扩增7 d，之后将细胞培养在含1×10-7mol/L 的TAM 培养液中维持其耐药性。

MCF-7 细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各200 u/mL的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%（φ）CO2的培养箱中培养，每天更换1 次培养基，细胞融合度达到80%以上时，胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.4 MTT 法检测MCF-7 和MCF-7/TAMR 细胞的增殖活性

离心收集MCF-7 和MCF-7/TAMR 细胞，制成单细胞悬液，以6×103个/孔的密度将细胞接种于96孔板，细胞贴壁生长后，分别用含0、0.1、1、10、20 和50 μmol/L 的TAM 的培养基培养72 h，之后每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），置于培养箱中继续培养4 h，置于酶标仪上测定490 nm 波长处的吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率[细胞增殖抑制率=（1-实验组A 值/对照组A 值）×100%]，求出半数抑制浓度（IC50），计算耐药指数（RI）（RI=耐药细胞IC50/诱导前细胞IC50）。实验重复3次。

1.5 细胞分组与培养

将MCF-7/TAMR 细胞用浓度为0、10、20、40 和60 mol/L 芦荟大黄素处理细胞24 h，选择细胞毒性较小的40 mol/L芦荟大黄素进行后续实验。对数生长期MCF-7/TAMR细胞分为对照组和EGF组，对照组细胞不做处理，EGF 组细胞用10 nmol/L EGF 处理24 h，芦荟大黄素组细胞用40 mol/L 芦荟大黄素处理24 h，芦荟大黄素+EGF 组细胞先加入10 nmol/L EGF 处理24 h 后再加入40 mol/L 芦荟大黄素处理24 h。

1.6 MTT法检测细胞存活率

根据实验方法“1.3”测定各组细胞吸光度（A）值，计算细胞存活率（细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%）。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡率

预冷PBS 清洗细胞2 次，胰蛋白酶消化，PBS 将细胞重悬，离心后加入Binding buffer 500 μL将细胞重悬，分别加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，振荡混匀，避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.8 蛋白印迹法检测各蛋白表达情况

预冷PBS清洗细胞2次，裂解液裂解，离心取上清液，BCA 法检测蛋白浓度，煮沸变性。电泳2 h，湿转2 h，TBST 洗膜3 次，室温封闭1 h，Bax、Bcl-2、Ki67、EGF、p-EGFR、EGFR、HER2 和GAPDH 抗体（1∶1000）4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，二抗（1∶5000）室温孵育2 h，TBST 洗膜3 次，ECL 法显色，Image J 分析灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.9 统计学分析

采用SPSS21.0 统计学软件分析数据，计量资料均以表示，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，两样本比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCF-7/TAMR耐药细胞株建立

给予MCF-7 和MCF-7/TAMR 细胞不同浓度TAM 处理后，细胞增殖抑制率随TAM 浓度的升高而上升，等浓度TAM 下MCF-7 细胞增殖抑制率明显高于MCF-7/TAMR 细胞。MCF-7/TAMR 细胞的IC50为（36.29±2.04）μmol/L，高于MCF-7 细胞的IC50（11.37±1.74）μmol/L，MCF-7/TAMR 的耐药指数为（3.76±0.27）。提示成功建立MCF-7/TAMR 细胞株。见表1。

表1 MCF-7细胞和MCF-7/TAMR细胞增殖抑制率比较Table 1 Comparison of the proliferation inhibition rates between MCF-7 cells and MCF-7/TAMR cells(±s,n=3)

表1 MCF-7细胞和MCF-7/TAMR细胞增殖抑制率比较Table 1 Comparison of the proliferation inhibition rates between MCF-7 cells and MCF-7/TAMR cells(±s,n=3)

与0.1 μmol/L组比较：*P<0.05；与1 μmol/L组比较：#P<0.05；与10 μmol/L组比较：@P<0.05；与20 μmol/L组比较：&P<0.05。

细胞类型MCF-7细胞MCF-7/TAMR细胞c(TAM)/(μmol/L-1)0--0.115.52±0.993.28±0.88139.42±1.02*9.12±0.52*1048.21±0.69#17.92±0.34#2064.10±0.88@28.64±1.20@5082.95±0.61&36.28±0.76&

2.2 不同浓度芦荟大黄素对MCF-7/TAMR 细胞增殖活性的影响

MCF-7/TAMR 细胞存活率和Ki67 蛋白相对表达量随芦荟大黄素浓度的升高而降低，且具有浓度依赖性。提示芦荟大黄素能抑制MCF-7/TAMR 细胞增殖活性。见表2，图1。

图1 蛋白印迹法检测不同浓度芦荟大黄素对Ki67 蛋白表达的影响Figure 1 Effects of aloe emodin on Ki67 protein expression detected by Western blot

表2 不同浓度芦荟大黄素对细胞存活率和Ki67表达的影响Table 2 Effects of different concentrations of aloe emodin on the cell viability and Ki67 expression(±s,n=3)

表2 不同浓度芦荟大黄素对细胞存活率和Ki67表达的影响Table 2 Effects of different concentrations of aloe emodin on the cell viability and Ki67 expression(±s,n=3)

与0 mol/L 比较：*P<0.05；与10 mol/L 比较：#P<0.05；与20 mol/L 比较：@P<0.05；与40 mol/L比较：&P<0.05。

c（芦荟大黄素)/(mol·L-1）010204060细胞存活率/%10092.13±1.13*82.71±1.98*#70.26±1.27*#@61.50±0.75*#@&Ki671.08±0.030.99±0.02*0.75±0.02*#0.48±0.02*#@0.10±0.02*#@&

2.3 EGF对MCF-7/TAMR耐药细胞株的影响

2.3.1 EGF 对MCF-7/TAMR 细胞增殖的影响 EGF组细胞存活率和Ki67 蛋白相对表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。EGF 组EGF 蛋白相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3，图2。

图2 蛋白印迹法检测Ki67和EGF蛋白表达情况Figure 2 Expression of Ki67 and EGF protein detected by Western blot

表3 EGF对细胞存活率、Ki67和EGF表达的影响Table 3 Effects of EGF on the cell viability, Ki67 and EGF expression(±s,n=3)

表3 EGF对细胞存活率、Ki67和EGF表达的影响Table 3 Effects of EGF on the cell viability, Ki67 and EGF expression(±s,n=3)

与对照组比较：*P<0.05。

组别对照组EGF组细胞存活率/%100.0097.96±1.15 Ki670.88±0.050.82±0.03 EGF 0.35±0.020.72±0.03*

2.3.2 EGF 对MCF-7/TAMR 细胞凋亡的影响 EGF组细胞凋亡率和Bax 蛋白相对表达量低于对照组，EGF 和Bcl-2 蛋白相对表达量高于对照组（P<0.05），提示EGF 能抑制MCF-7/TAMR 细胞凋亡。见表4，图3。

图3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况以及蛋白印迹法检测细胞凋亡相关蛋白和EGFFigure 3 Detection of cell apoptosis by flow cytometry and apoptosis related proteins and EGF by Western blot

表4 EGF对细胞凋亡率及凋亡相关蛋白和EGF表达的影响Table 4 Effects of EGF on the apoptosis rate and expressionof apoptosis-related proteins and EGF(±s,n=3)

表4 EGF对细胞凋亡率及凋亡相关蛋白和EGF表达的影响Table 4 Effects of EGF on the apoptosis rate and expressionof apoptosis-related proteins and EGF(±s,n=3)

与对照组比较：*P<0.05。

组别对照组EGF组细胞凋亡率/%5.63±0.491.57±0.24*Bax 0.72±0.050.36±0.06*Bcl-20.15±0.040.70±0.04*EGF 0.10±0.030.90±0.04*

2.3.3 EGF对MCF-7/TAMR细胞中蛋白的影响 EGF组p-EGFR、HER2和EGF 蛋白相对表达量高于对照组（P<0.05），而总EGFR 蛋白相对表达量两组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表5，图4。

图4 蛋白印迹法检测细胞中p-EGFR、EGFR、HER2 和EGF蛋白表达情况Figure 4 Expression of p-EGFR,EGFR,HER2 and EGF pro‐teins measured by Western blot

表5 EGF对p-EGFR和HER2蛋白相对表达量的影响Table 5 Effects of EGF on relative expression levels of p-EGFR and HER2 proteins(±s,n=3)

表5 EGF对p-EGFR和HER2蛋白相对表达量的影响Table 5 Effects of EGF on relative expression levels of p-EGFR and HER2 proteins(±s,n=3)

与对照组比较：*P<0.05。

组别对照组EGF组p-EGFR 0.38±0.030.59±0.03*EGFR 0.89±0.040.87±0.05 HER20.48±0.040.64±0.04*EGF 0.24±0.060.50±0.05*

2.4 EGF 逆转芦荟大黄素对MCF-7/TAMR 耐药细胞株的影响

2.4.1 EGF逆转芦荟大黄素对MCF-7/TAMR细胞增殖活性的影响 细胞存活率、Ki67 和EGF 蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较，芦荟大黄素组细胞存活率、Ki67和EGF蛋白相对表达量降低（P<0.05）；与芦荟大黄素组比较，芦荟大黄素+EGF组细胞存活率、Ki67和EGF蛋白相对表达量升高（P<0.05）。提示EGF可降低芦荟大黄素对细胞增殖活性的抑制作用。见表6，图5。

表6 各组细胞存活率、Ki67和EGF蛋白表达比较Table 6 Comparison of the cell survival rate, Ki67 and EGF protein expression in each group（±s,n=3）

表6 各组细胞存活率、Ki67和EGF蛋白表达比较Table 6 Comparison of the cell survival rate, Ki67 and EGF protein expression in each group（±s,n=3）

与对照组比较：*P<0.05；与芦荟大黄素组比较：#P<0.05。

组别对照组芦荟大黄素组芦荟大黄素+EGF组细胞存活率/%100.0073.51±3.73*87.52±2.46*#Ki670.87±0.030.18±0.02*0.37±0.04*#EGF 0.77±0.030.10±0.04*0.23±0.02*#

图5 蛋白印迹法检测Ki67和EGF蛋白表达Figure 5 Expression of Ki67 and EGF protein measured by Western blot

2.4.2 EGF 逆转芦荟大黄素对MCF-7/TAMR 细胞凋亡的影响 细胞凋亡率以及EGF、Bax 和Bcl-2 蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较，芦荟大黄素组细胞凋亡率和Bax 蛋白相对表达量升高，EGF 和Bcl-2 蛋白相对表达量降低（P<0.05）；与芦荟大黄素组比较，芦荟大黄素+EGF 组细胞凋亡率和Bax 蛋白相对表达量降低，EGF 和Bcl-2 蛋白相对表达量升高（P<0.05）。提示EGF 可降低芦荟大黄素对细胞凋亡的促进作用。见表7，图6。

图6 流式细胞仪检测细胞凋亡情况及蛋白印迹法检测细胞中Bax、Bcl-2和EGF蛋白表达水平Figure 6 Detection of cell apoptosis by flow cytometry and the expression of Bax,Bcl-2 and EGF proteins by Western blot

表7 各组细胞凋亡率、Bax、Bcl-2和EGF蛋白相对表达量比较Table 7 Comparison of the cell apoptosis rate and relative expres‐sion of Bax,Bcl-2 and EGF proteins in each group（±s,n=3）

表7 各组细胞凋亡率、Bax、Bcl-2和EGF蛋白相对表达量比较Table 7 Comparison of the cell apoptosis rate and relative expres‐sion of Bax,Bcl-2 and EGF proteins in each group（±s,n=3）

与对照组比较：*P<0.05；与芦荟大黄素组比较：#P<0.05。

组别对照组芦荟大黄素组芦荟大黄素+EGF组细胞凋亡率/%1.36±0.2513.46±0.46*6.94±0.45*#Bax 0.88±0.051.13±0.02*1.01±0.03*#Bcl-21.04±0.020.40±0.04*0.53±0.04*#EGF 1.12±0.030.12±0.03*0.43±0.04*#

2.4.3 EGF 逆转芦荟大黄素对EGF/EGFR/HER2 信号通路的影响 EGF、p-EGFR 和HER2 蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较，芦荟大黄素组EGF、p-EGFR 和HER2 蛋白相对表达量降低（P<0.05）；与芦荟大黄素组比较，芦荟大黄素+EGF组EGF、p-EGFR和HER2蛋白相对表达量升高（P<0.05）。EGFR 蛋白相对表达量组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。提示EGF可降低芦荟大黄素对EGF/EGFR/HER2 信号通路的抑制作用。见表8，图7。

表8 各组p-EGFR、EGFR、EGF和HER2蛋白相对表达量比较Table 8 Comparison of the relative expression of p-EGFR,EGFR,EGF and HER2 proteins in each group（±s,n=3）

表8 各组p-EGFR、EGFR、EGF和HER2蛋白相对表达量比较Table 8 Comparison of the relative expression of p-EGFR,EGFR,EGF and HER2 proteins in each group（±s,n=3）

与对照组比较：*P<0.05；与芦荟大黄素组比较：#P<0.05。

组别对照组芦荟大黄素组芦荟大黄素+EGF组p-EGFR 0.97±0.040.31±0.03*0.73±0.02*#EGFR 0.99±0.031.01±0.020.98±0.03 HER20.99±0.040.37±0.03*0.82±0.05*#EGF 0.87±0.030.35±0.02*0.64±0.03*#

图7 各组细胞中各蛋白表达情况Figure 7 Protein expression in cells of each group

3 讨论

内分泌治疗因其低毒性以及耐受性好等特点，能显著改善激素受体阳性乳腺癌患者预后，但是长期治疗部分患者易出现耐药性，导致患者生存率降低，因此寻找癌细胞产生耐药性的具体机制对于提高乳腺癌患者生存率至关重要。本课题组前期预实验发现芦荟大黄素对乳腺癌MCF-7 细胞具有抑制作用，但是对其耐药性的影响未进行探讨，因此本研究主要探讨芦荟大黄素是否能逆转乳腺癌细胞的耐药性及其具体机制。

近些年，芦荟大黄素在抗肿瘤方面的作用受到广泛关注，研究发现，芦荟大黄素可诱导胃癌细胞凋亡，降低癌细胞增殖能力[7]。董锦忠等[8]研究发现，芦荟大黄素可抑制肺癌A549 细胞增殖、迁移和侵袭。杜学峰等[9]研究表明芦荟大黄素通过抑制肝癌细胞增殖，诱导癌细胞发生自噬和凋亡，从而发挥抗肝癌作用。为研究芦荟大黄素对MCF-7 耐药性的影响，本研究首先建立MCF-7/TAM 耐药细胞株，通过检测MCF-7/TAM 细胞的增殖抑制率和耐药指数，确定成功诱导出MCF-7/TAM 耐药细胞。给予MCF-7/TAM 细胞不同浓度芦荟大黄素处理，结果显示：随着芦荟大黄素浓度的升高，细胞存活率逐渐降低，且具有浓度依赖性，而且Ki67 蛋白表达量随芦荟大黄素浓度的升高逐渐降低。结果表明，芦荟大黄素可降低MCF-7/TAM细胞增殖活性。

肿瘤细胞通过自分泌可产生大量生长因子，其中EGF 是促进上皮增生的重要因子，通过与其受体EGFR 结合，活化EGFR，激活细胞内一系列信号转导通路，从而促进肿瘤细胞增殖、浸润和侵袭。研究发现，EGF 通过激活EGFR/ROS 信号通路可增强人胶质母细胞瘤多形性细胞的侵袭潜能[10]。Zhang等[11]研究发现EGF 可诱导肝癌HepG2 细胞发生上皮间质转化，而丹参酮降低EGF 表达可逆转上皮间质转化过程。Zhao 等[12]研究表明EGF 通过活化STAT3 诱导HIF-1 表达上调，从而促进结直肠癌SW480 细胞增殖和转移。本研究用10 nmol/L EGF处理细胞，对MCF-7/TAM 细胞存活率和Ki67 蛋白表达量无显著影响，而显著降低细胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax的表达量，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达量升高。结果表明，EGF 可促进MCF-7/TAM 细胞增殖，抑制其凋亡。为进一步研究芦荟大黄素是否是通过调节EGF发挥抗癌作用，本研究先用10 nmol/L EGF 处理细胞后，再用芦荟大黄素处理细胞，结果显示，与芦荟大黄素组比较，芦荟大黄素+EGF 组细胞存活率和Ki67蛋白表达量升高，而细胞凋亡率和Bax 蛋白表达降低，Bcl-2 蛋白表达升高。结果表明，EGF 可降低芦荟大黄素对MCF-7/TAM 细胞的促凋亡作用。

表皮生长因子系统（EGFs）由EGF 和EGFR 组成，EGFR 家族是跨膜受体酪氨酸激酶的一种，包括EGFR、HER2、HER3 和HER44 个成员，该家族通过调控多种与细胞生长相关的基因从而调节细胞周期影响细胞增殖、迁移和分化。EGFR 存在于所有细胞表面，对多条信号转导通路具有调控作用。Dong 等[13]研究发现，EGFR 在宫颈癌细胞中表达升高，circMYBL2 通过上调EGFR 可增强宫颈癌细胞对紫杉醇的耐药性，降低其敏感性，促进癌细胞的恶性生物行为学。沉默非小细胞肺癌中CD44的表达可使EGFR 信号失活，从而降低癌细胞的增殖活性，增强癌细胞对顺铂的敏感性[14]。HER2 上调可促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡[15]。PROM2 通过激活HER2 促进乳腺癌细胞迁移、侵袭和增殖[16]。本研究结果显示，与对照组比较，EGF处理细胞后，p-EGFR 和HER2表达上调，芦荟大黄素处理细胞可降低p-EGFR和HER2表达；而与芦荟大黄素组比较，芦荟大黄素+EGF 组p-EGFR和HER2 表达升高，结果提示芦荟大黄素可抑制EGF/EGFR/HER2 信号通路，降低乳腺癌内分泌耐药性。

综上所述，芦荟大黄素可降低乳腺癌内分泌耐药性，其可能是通过抑制EGF/EGFR/HER2信号通路发挥作用，此机制为临床治疗乳腺癌提供了理论依据。