人参黄精膏质量标准研究

贺清辉，罗进，杜军，罗艳萍，王红刚，周静仪，杨嘉文

［1.安利（中国）研发中心有限公司，广东 广州 510730；2.广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244；3.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006］

随着社会的发展和生活节奏的加快，女性健康越来越受到社会的关注。中医学认为气、血均为人体生命活动的基本物质，为人之本源[1]。《黄帝内经》载有“人之所有者，血与气耳”，充分说明了气、血对于人体的重要性[2]。中医学上对女性病理的研究均统一认为“女子以气为用，以血为本”的观点[3]。由于肾气渐衰，天癸将绝，冲任亏虚，气血暗耗，故导致了阴阳气血失衡[4]，从而引发女性疾病。

人参黄精膏由人参、玉竹、黄精、枸杞、玫瑰花等5 种药食同源原料及新食品原料丹凤牡丹花组成。处方中的人参具有大补元气、补脾益肺、生津养血等功效；黄精补气养阴，健脾，润肺，益肾；枸杞滋补肝肾，益精明目；玉竹养阴润燥，生津止渴；玫瑰花行气解郁[5]；丹凤牡丹花是2013 年国家卫计委批准的新食品原料，富含多酚、氨基酸、维生素、矿物质等功能营养成分[6]；全方滋阴补气，补而不腻。人参黄精膏作为一款功能食品，质量标准主要参考国家标准GB/T 31326《植物饮料》，包括感官、理化、污染物限量及微生物限量等指标。但本品中的人参、玉竹、黄精、枸杞、玫瑰花、丹凤牡丹花等富含皂苷、黄酮和多糖等活性成分，现有质量标准无法体现配方中化学成分的多样性和复杂性。本研究旨在建立人参、枸杞、玫瑰花、丹凤牡丹花的薄层鉴别方法，并建立粗多糖的质量分数测定方法，为提升人参黄精膏的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

KQ-500DE 超声波处理器（昆明市超声仪器有限公司）；ATS4薄层点样机（瑞士卡玛公司）；Visual‐izer 薄层呈像仪（瑞士卡玛公司）；ME-203 型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；TC-15 电热套（海宁市新华医疗器械厂）；RE-300 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；UV-2450 紫外-可见分光光度计（岛津仪器有限公司）。

1.2 试药

人参黄精膏（批号S2202003、S2202004、S2202005、S2202006、S2202007，广东一方制药有限公司生产）；人参皂苷Rg1（110703-201832）、人参皂苷Re（110754-202028）、人参对照药材（120917-201401B）、枸杞对照药材（121072-201412B）、玫瑰花对照药材（121508-201607B）均由中国药品生物制品检定所提供；人参皂苷Rb1（S299-D25,成都曼斯特生物科技有限公司）；丹凤牡丹花对照药材（DZ12012051，经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为丹凤牡丹Paeonia ostiiT.Hong et J.X.Zhang的干燥花朵）；无水葡萄糖（天津市天新精细化工开发中心）、苯酚（广州化学试剂厂）、浓硫酸（广州化学试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 人参薄层鉴别 参考《中国药典》人参药材鉴别方法，取本品约5.0 g，加三氯甲烷30 mL，加热回流1 h，弃去三氯甲烷，残渣挥干溶剂，加水1.0 mL搅拌溶解，加水饱和的正丁醇20 mL，超声处理30 min，吸取上清液，加3 倍量氨试液，摇匀，放置分层。取上层溶液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为人参黄精膏供试品溶液。另取人参对照药材0.5 g，同法制成人参对照药材溶液。分别取人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1 对照品，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的溶液，作为对照品溶液。按人参黄精膏处方比例，去掉人参后，依法制成人参黄精膏缺人参的阴性供试品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0502）试验，吸取上述溶液各5µL，分别点于同一默克高效板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比15∶40∶22∶10）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）和日光下检视，在供试品、对照药材和对照品薄层色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，缺人参阴性样品则无相应的斑点。结果见图1。

图1 人参对照品、人参对照药材及人参黄精膏样品薄层色谱图Figure 1 TLC identification of Ginseng Radix et Rhizome in Renshen Huangjing ointment samples

2.1.2 枸杞薄层鉴别[7]取本品约5.0 g，加乙酸乙酯20 mL 振摇提取，分取乙酸乙酯液，浓缩至约1 mL，作为人参黄精膏供试品溶液。另取枸杞对照药材1.0 g，加水50 mL，煮沸15 min，滤过，滤液用乙酸乙酯20 mL 振摇提取，同法制成对照药材溶液。按人参黄精膏处方比例，去掉枸杞，依法制成人参黄精膏缺枸杞阴性供试品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（体积比6∶3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。在供试品与对照药材薄层色谱相应的位置上，显相同亮蓝色荧光斑点，缺枸杞阴性样品无相应的斑点，结果见图2。

图2 枸杞对照药材与人参黄金膏样品薄层色谱图Figure 2 TLC identification of Lycii Fructus in Renshen Huangjing ointment samples

2.1.3 丹凤牡丹花薄层鉴别[8]取本品约5.0 g，加水50 mL，溶解离心，取上清液蒸干，残渣加甲醇5 mL，溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取丹凤牡丹花对照药材1.0 g，加水50 mL，煮沸30 min，离心，取上清液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，滤过，取续滤液作为对照药材溶液。按人参黄精膏处方比例，去掉丹凤牡丹花后，依法制成人参黄精膏缺丹凤牡丹花阴性样品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液各2µL分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（体积比5∶3∶1）溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，供试品与对照药材色谱相同位置上，显相同颜色的斑点，缺丹凤牡丹花阴性样品则无相应斑点，结果见图3。

图3 丹凤牡丹花对照药材和人参黄精膏样品薄层色谱图Figure 3 TLC identification of Paeonia ostii Flos in Renshen Huangjing ointment samples

2.1.4 玫瑰花的薄层鉴别[8]取本品约2.0 g，加甲醇20 mL，超声过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL 溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取玫瑰花对照药材0.5 g，加甲醇20 mL，超声过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL 溶解，滤过，取续滤液作为对照药材溶液。按人参黄精膏处方比例，去掉玫瑰花后，依法制成人参黄精膏缺玫瑰花阴性样品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0502）试验，吸取阴性样品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各5µL分别点于同一GF254薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（体积比5∶5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品与对照药材色谱相同的位置上，显相同颜色的主斑点，缺玫瑰花阴性样品则无相应的斑点，结果见图4。

图4 玫瑰花对照药材与人参黄金膏样品薄层色谱图Figure 4 TLC identification of Rosae Rugosae Flos in Renshen Huangjing ointment samples

2.2 紫外-可见分光光度法测定粗多糖的质量分数[9-10]

2.2.1 葡萄糖对照品溶液的制备 称取0.100 g 葡萄糖于量瓶中，加水溶解，定容至1000 mL，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取样品0.500 g，置于50 mL具塞离心管内。用5 mL水浸润样品，缓慢加入20 mL无水乙醇，摇匀，超声提取30 min。提取液于4000 r/min 离心10 min，弃去上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇溶液洗涤、离心。用水将上述不溶物转移入圆底烧瓶，加入50 mL 水，超声提取30 min。冷却，过滤，重复提取2 次。将滤液转移至200 mL 容量瓶中，残渣洗涤2～3 次，洗涤液转移至量瓶，加水定容，即得。

2.2.3 检测波长的确定 取葡萄糖对照品溶液、样品溶液各1 mL 于具塞试管中，加入5%苯酚溶液1 mL，然后迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀。静置10 min，充分混匀并于30 ℃水浴中反应20 min，于400～600 nm 波长进行紫外-可见光谱扫描，结果见图5。

图5 葡萄糖对照品溶液与供试品溶液紫外可见光谱图Figure 5 UV-Vis spectra of glucose solution and sample solution

可见，葡萄糖对照品溶液的最大吸收波长为490 nm，人参黄精膏供试品溶液的最大吸收波长为487 nm，两组最大吸收波长接近。结合参考文献，选择490 nm波长作为检测波长。

2.2.4 标准曲线与线性范围 精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用蒸馏水补至1.0 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，再迅速加入浓硫酸5.0 mL。静置10 min，充分混匀并于30 ℃水浴中反应20 min，在490 nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程y=0.0088x+0.0283，R2=0.9995，表明葡萄糖质量浓度在19.62～98.1 μg/mL 范围内与吸光度线性关系良好。

2.2.5 重复性试验 取同一批号人参黄精膏样品（批号S2201012），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别取1 mL 于具塞试管中，加入5%苯酚溶液1 mL，然后迅速加入浓硫酸5.0 mL，静置10 min，充分混匀并于30 ℃水浴中反应20 min，在490 nm 波长处测定吸光度，计算粗多糖质量分数及其RSD 值。结果显示，该批次人参黄精膏样品的粗多糖质量分数在1.74%～1.81%范围内，6 次的测定平均值为1.77%，RSD 值为1.24%，表明方法重复性较好。

2.2.6 精密度试验 取同一批号人参黄精膏样品（批号S2202003），按“2.2.5”项方法进行粗多糖质量分数测定，每天测定1 次，连续测定3 d，结果计算得日间精密度RSD值为2.65%。由两名操作员独立对同一批号人参黄精膏样品（批号S2202003）按“2.2.5”项方法进行粗多糖质量分数测定，结果计算得RSD值为0.8%。

2.2.7 回收率试验 取同一批号人参黄精膏样品（批号S2202003），按“2.2.2”项方法平行制备9 份供试品溶液，分别取供试品溶液各0.5 mL 于具塞试管中，分别加入0.5 mL 相当于样品含量25%、50%、100%的葡萄糖对照品溶液各3 份，按“2.2.5”项方法进行粗多糖质量分数测定，计算加样回收率，结果见表1。可见，加样回收率在96.19%～98.29%之间，平均回收率为97.45%，RSD 值为0.74%，表明方法回收率较好。

表1 人参黄精膏中葡萄糖的回收率试验结果Table 1 Results of recovery test of glucose in Renshen Huangjing ointment

2.2.8 耐用性试验 取同一批号人参黄精膏样品（批号S2202003），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，考察超声时间分别为25、30、35 min 时粗多糖的质量分数，并计算其RSD值。结果显示，超声25、30、35 min 时粗多糖的质量分数分别为1.71%、1.76%、1.72%，RSD值为1.53%，表明方法耐用性良好。

2.2.9 粗多糖质量分数的测定 取5批人参黄精膏，按“2.2.2”项方法制备成供试品溶液，再按“2.2.5”项方法进行粗多糖质量分数测定。结果显示，批号S2202003、S2202004、S2202005、S2202006、S2202007的人参黄精膏中粗多糖质量分数分别为1.71%、1.74%、1.63%、1.54%、1.63%。表明采用该方法测定人参黄精膏中的粗多糖质量分数，结果稳定、重复性好，可有效控制人参黄精膏的质量。

3 讨论

本研究以对照药材及特征成分为对照进行人参黄精膏中人参、枸杞等药材的薄层色谱鉴别研究，通过对供试品溶液的制备方法、展开溶剂的种类与比例、点样量等因素进行优化，确定了人参、枸杞、丹凤牡丹花、玫瑰花4种药材的薄层色谱鉴别条件，结果显示薄层色谱斑点清晰、分离明显，阴性对照无干扰，专属性好，可用于人参黄精膏的质量控制。人参的薄层鉴别中，由于供试品溶液的萃取步骤较多，人参皂苷等特征成分提取不完全，导致斑点不清晰，因此溶剂萃取时需充分振摇，确保提取完全。枸杞薄层鉴别中的展开剂比例会影响鉴别结果，因此需要充分优化，以达到更好的分离效果。丹凤牡丹花的供试品溶液制备方法简单，但需控制好溶液浓度和点样量，浓度过高或点样量大，均会导致斑点分离效果差。

另外，在对黄精、玉竹进行薄层鉴别的研究中发现，黄精、玉竹富含多糖成分易与配方中人参、枸杞中的多糖产生干扰。本研究多次分别对多糖、黄酮类等成分进行薄层鉴别试验，均发现阴性样品干扰较大，且无专属性，薄层的斑点不清晰，故认为薄层法不适用黄精和玉竹的薄层鉴别。后期考虑采用HPLC 法对其质量控制进行研究，以完善人参黄精膏的质量控制体系。

人参黄精膏中含有人参、玉竹、黄精、枸杞等富含多糖的中药，而多糖类成分具有良好的免疫调节作用，因此，本研究采用紫外-可见分光光度法建立了人参黄精膏中的粗多糖质量分数测定方法，方法学考察结果表明该方法重复性好、检测结果准确，可用于控制人参黄精膏质量。《中国药典》中黄精多糖含量采用蒽酮-硫酸法，而玉竹和枸杞的多糖采用苯酚-硫酸法。本研究对比2 个多糖检测方法，发现采用苯酚-硫酸法测定人参黄精膏中的多糖，干扰较少，方法简单易操作，重现性好，可用于大规模的连续生产检测。