牛蒡复合果蔬酵素发酵工艺优化及品质变化跟踪

王乃馨，李 超，苗敬芝，曹泽虹，李 文，邵 颖

（徐州工程学院 食品与生物工程学院 江苏省食品资源开发与质量安全重点建设试验室，江苏 徐州 221018）

牛蒡（Arctium lappaL.）又名为大力子、东洋参等，自20世纪90年代开始就在我国作为经济作物进行推广种植。江苏省徐州市丰县、沛县两地是我国重要种植基地之一。作为一种药食同源的植物种类，牛蒡营养丰富，其根状茎中蛋白质、菊糖、精氨酸、天冬氨酸、镁、铁、锌等矿物质元素及维生素C（vitamin C，VC）、维生素B6（vitamin B6，VB6）等含量较高[1]，还含有醛类、牛蒡酸类、硫炔类、多酚类等多种活性成分以及膳食纤维，被证实具有较好的抑菌功效和促进肠胃蠕动效果[2-4]。新鲜牛蒡脆嫩多汁，具有明显的甜味，若挖掘采收后保存不当，嫩茎极易老化，发韧发硬，影响了作为蔬菜的口感。通过切片烘干等工艺制成的饮片不仅强化了原本略带土腥味的缺陷，而且使口味偏苦，丧失原有的清甜风味。

酵素是一种新型微生物发酵品，可在一定程度上改良原料风味、避免口感变差的问题。因原料种类、发酵菌种、发酵环境等条件差异，酵素在生产过程中发生理化变化，使原料中大分子被分解或转化成小分子代谢产物或者新的功能性物质[5-6]。酵素产品具有抗氧化[7-8]、提高免疫力[9-10]、降血脂、控体质量[11-12]、改善肠道功能及菌群[13-14]等功效。美国天然保健品市场2013年草药类膳食补充剂销售额就已经达9.94亿美元，其中凤梨酵素为875.59万美元[15]。亚洲地区有成熟的酵素生产企业，如台湾大汉酵素生物科技股份有限公司[16]、日本万田和大高公司和佰纳吉公司[17]。目前国内已有大量高校和企业在酵素发酵方面投入大量时间和资源进行研究。但由于前期工作仍在积累中，仅有中华人民共和国工业和信息化部在2018年发布的《植物酵素》[18]和《酵素产品分类导则》[19]这两个企业标准和少量团体标准，尚无国家标准。我国酵素品质体系、检测方法、制作方法有待进一步完善。目前，已有关于牛蒡酵素的研究报道。王乃馨等[20]以牛蒡为主要原料，混合多种蔬菜与水果制备酵素，通过响应面试验设计优化了酵素配方，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活力最高可达43.80 U/mL。张艳明等[21]以气调糖化后的牛蒡、紫皮葡萄为原料，制备葡萄牛蒡酵素并确定了最佳发酵工艺参数。

本研究以牛蒡为主要原料，复合橘子、苹果、山楂、梨、火龙果、木瓜、枸杞、包菜、芹菜等果蔬，以米曲霉（Aspergillus oryzae）为发酵菌种，制备牛蒡复合果蔬酵素。以超氧化物歧化酶（SOD）活性为评价指标，通过单因素试验和Box-Behnken响应面试验设计优化其发酵条件。并考察发酵过程中功效酶（SOD、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶）活性以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羟自由基、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-diazo-bis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid，ABTS）自由基清除率的动态变化，以期为牛蒡复合果蔬酵素的生产工艺优化和综合性开发提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牛蒡：徐州绿姿农产品专业合作社；枸杞：宁夏活性农副产品购销有限公司；橘子、苹果、山楂、梨、火龙果、木瓜、枸杞、包菜、芹菜、白砂糖：市售；米曲霉（Aspergillus oryzae）：济宁玉园生物科技有限公司；福林酚、DPPH、ABTS、酪蛋白、邻二氮菲、抗坏血酸（均为生化试剂或分析纯）：合肥博美生物科技有限责任公司；硼酸、铁氰化钾、三氯化铁、双氧水、三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、亚硝酸钠、硫酸亚铁、过硫酸钾、甲醇、甲醛和碳酸钠（均为分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SHA-C水浴恒温振荡器：江苏金坛恒农仪器厂；101A-2型数显电热鼓风干燥箱：上海浦东跃欣科学仪器厂；UV-2100紫外分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；ZJP-A1430电热恒温培养箱：上海智诚分析仪器制造有限公司；PHS-3E pH计：上海精密科学仪器有限公司；LDZX-30KBS立式高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；3K30冷冻高速离心机：德国Sigma公司；SW-CJ-2FD垂直洁净净化超净工作台：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡复合果蔬酵素加工工艺流程及操作要点

操作要点：

原料预处理：橘子、苹果、山楂、梨、火龙果、木瓜用纯水清洗后去皮、去虫眼、去核，包菜、芹菜去老叶、黄叶，均切成1 cm3左右的方块，枸杞清洗沥干后直接使用。新鲜牛蒡彻底清洗除去泥沙、细根须等杂物，浸泡在纯水中快速去皮、切去老根，以避免切口快速褐变。迅速将牛蒡切成1 cm3左右小块投入发酵罐。果蔬原料比例为牛蒡20%，山楂18%、枸杞11%、苹果4%、其他水果蔬菜47%。调整料液比为1∶1.5（g∶mL）。

添加菌种、调整糖度：米曲霉孢子按一定比例加入发酵罐中，按原料质量15%的比例添加白糖，混合均匀。

控温发酵：发酵罐体内应留有一定空间，密闭后进行控温发酵。期间根据发酵情况需适时开罐放气以防爆罐。至49 d完成发酵，跟踪检测发酵过程中酵素品质变化，实验结束后，用400目滤布滤去发酵液中果蔬渣，再用0.2 μm孔径滤膜过滤除菌后灌装，于阴凉避光处储存。

1.3.2 牛蒡复合果蔬酵素发酵工艺优化单因素试验

采用单因素轮换法，分别考察发酵温度（29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃、33 ℃）、发酵时间（3 d、7 d、14 d、21 d、28 d）、菌种接种量（1%、2%、3%、4%、5%）对牛蒡复合果蔬酵素SOD活性的影响。

1.3.3 牛蒡复合果蔬酵素发酵工艺优化响应面试验

在单因素试验的基础上，以酵素的SOD活性（Y）为响应值，以发酵温度（A）、发酵时间（B）和米曲霉孢子接种量（C）为主要考察因素，采用Design-Expert V10.0.3软件进行Box-Behnken响应面试验设计，试验因素与水平见表1。

表1 发酵条件优化Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation conditions optimization

1.3.4 分析检测

（1）产品理化指标检测

总酸的测定：参照国标GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》[22]；酒精的测定：采用酒精计；可溶性固形物测定：采用阿贝折光仪；pH值测定：采用pH计。

（2）酶活性

SOD活性的测定：参照国标GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定》[23]；淀粉酶活性的测定：参照靳利娥等[24]的试验方法；蛋白酶活性测定：参照GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》[25]；脂肪酶活性的测定：参照国标GB/T 23535—2009《脂肪酶制剂》的指示剂滴定法[26]。

（3）抗氧化性能

DPPH自由基清除率的测定：参考LUO W等[27]的试验方法；羟自由基清除率的测定：参考ZHANG Z F等[28]的试验方法；ABTS自由基清除率的测定：参考RE R等[29]的试验方法。

1.3.5 数据处理与分析

每组试验重复3次，试验数据采用Excel2007、SPSS22.0分析软件进行分析处理及作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵温度对酵素品质影响

发酵温度对牛蒡复合果蔬酵素SOD活性影响的结果如图1所示，随着发酵温度在29～32 ℃范围内的不断升高，酵素中的SOD活性不断提升，其原因可能是，发酵温度越来越接近米曲霉生长的最佳温度，利于酶促反应和微生物代谢发育[30]；发酵温度为32 ℃时，SOD活性达到最高值，为（30.83±0.48）U/mL；继续升高发酵温度，SOD活性有所下降。只有将发酵温度控制在合适的范围才能促进微生物生长，利于酵素次级代谢产物的积累。因此，最终选取发酵温度31 ℃、32 ℃、33 ℃进行响应面试验。

图1 发酵温度对牛蒡复合果蔬酵素超氧化物歧化酶活性的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on superoxide dismutase activity of burdock compound fruit and vegetable Jiaosu

2.1.2 发酵时间对酵素品质影响

发酵时间对牛蒡复合果蔬酵素SOD活性影响的结果如图2所示，随着发酵时间在3～21 d内的增加，SOD活性快速增加；发酵时间为21 d时，酵素中SOD活性达（46.08±2.84）U/mL；当继续增加发酵时间，SOD活性增长变缓。因此，最终选取发酵时间14 d、21 d、28 d进行响应面试验。

图2 发酵时间对牛蒡复合果蔬酵素超氧化物歧化酶活性的影响Fig.2 Effect of fermentation time on superoxide dismutase activity of burdock compound fruit and vegetable Jiaosu

2.1.3 接种量对酵素品质影响

接种量对牛蒡复合果蔬酵素SOD活性影响的结果如图3所示，随着接种量在1%～3%范围内的不断增加，SOD活性随之提升，至接种量为3%时，SOD活性达到最高值，为（38.46±0.62）U/mL，再增加接种量，SOD活性略有下降。其原因可能是在发酵过程中，接种量较低时，发酵能力较低，接种量过高时，因初始发酵液中营养有限，不能满足全部微生物生长所需的营养物质限制了其生长。因此，最终选取接种量1%、2%、3%进行响应面试验。

图3 接种量对牛蒡复合果蔬酵素超氧化物歧化酶活性的影响Fig.3 Effect of inoculum on superoxide dismutase activity of burdockcompound fruit and vegetable Jiaosu

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面模型的建立与分析

结合单因素试验结果，选取发酵温度（A）、发酵时间（B）、接种量（C）3个因素为自变量，以SOD活性（Y）为响应值，设计Box-Behnken响应面试验，经Design-Expert 10.0.3数据分析软件对响应值数据进行多元回归拟合分析，方差分析见表2。

各因素水平对牛蒡复合果蔬酵素SOD活性影响的二次回归拟合方程如下：

由表2可知，牛蒡复合果蔬酵素发酵工艺优化回归模型的P值＜0.000 1，差异极显著，失拟项的P=0.079 5＞0.05，差异不显著，模型决定系数R2=0.999 0，调整决定系数R2adj=0.997 7，变异系数（coefficient of variation，CV）=0.43%。说明发酵条件优化试验模型和实际情况拟合度良好，可以稳定重现，能够对牛蒡复合果蔬酵素发酵工艺条件进行预测。

表2 回归模型的方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

2.2.2 验证试验

经建模优化分析，得到牛蒡复合果蔬酵素SOD活性的最佳发酵工艺条件为：发酵温度32.054 ℃、发酵时间25.789 d、接种量2.440%，该条件下SOD活性预测值为（48.233±0.480）U/mL。根据试验所需条件及实际的可操作性，将牛蒡复合果蔬酵素发酵工艺条件修正为：发酵温度32 ℃、发酵时间26 d、接种量2.5%，在此条件下进行3次重复验证试验，对试验结果取平均值，得牛蒡复合果蔬酵素的SOD活性实际值为（50.083±1.950）U/mL，与预测值差异不大，说明响应面法对牛蒡复合果蔬酵素发酵工艺优化具有实际可行性，可为后续实际生产应用提供理论基础。

2.3 牛蒡复合果蔬酵素品质在发酵过程中的变化

2.3.1 发酵过程中酶活性变化

不同功效酶活性变化如图4所示。发酵时间在0～13 d范围内，淀粉酶活性逐渐增强，淀粉酶活性由（25.06±1.34）U/mL升至最高值（68.55±1.20）U/mL，随着发酵时间的延长，淀粉酶活性基本稳定在44 U/mL左右；发酵时间在0～26 d范围内，SOD活性由（24.17±0.80）U/mL升至最高值（52.09±1.02）U/mL，随着发酵时间的延长，SOD活性基本稳定在48 U/mL左右；在整个发酵过程中，蛋白酶活性偏低，当发酵时间在0～5 d范围内，蛋白酶活性由最初的（12.16±1.24）U/mL升至最高值（18.55±0.81）U/mL，随着发酵时间的继续延长，蛋白酶活性维持在缓慢下降状态；发酵时间在0～19 d范围内，脂肪酶活性由最初的（2.67±0.67）U/mL升至（6.78±0.81）U/mL，随着发酵时间的延长，脂肪酶活性约稳定在7 U/mL。各种酶活性在发酵过程中存在差异，但均呈现先增加后减少然后基本稳定这一变化规律，与相关研究结果一致[31-32]。通过发酵处理可以明显提升部分功能酶活力，酶活性较好的发酵时间为13～26 d。部分研究也证明了当植物酵素发酵到后期时，除了部分微生物代谢产物、次生代谢产物、小分子物质缓慢积累，其他活性或成分一般不断减少[7，20]。

图4 发酵过程中牛蒡复合果蔬酵素的不同酶活性变化Fig.4 Changes of different enzyme activities of burdock compound fruit and vegetable Jiaosu during fermentation

2.3.2 发酵过程中抗氧化活性变化

抗氧化活性变化如图5所示，在发酵过程中，不同自由基清除率总体呈现先上升后趋于稳定或略微降低的规律。当发酵时间在0～26 d的范围内，ABTS自由基清除率由最初（51.27±0.65）升至（68.71±0.41）%，随着发酵时间的延长，ABTS自由基清除率有所下降；当发酵时间在0～21 d的范围内，DPPH自由基清除率由最初（47.61±0.45）%上升至（60.57±0.25）%，随着发酵时间的延长，DPPH自由基清除率下降；当发酵时间在0～26 d的范围内，羟自由基清除率由最初（45.08±0.25）%上升至（56.36±1.06）%，随着发酵时间的延长，羟自由基清除率下降。通过发酵，均可以在不同程度提升这三种自由基的清除率。但各种自由基清除率的变化并不完全与SOD活性的变化一致，可能是其他成分影响了抗氧化效果。因此，自由基清除率较好的发酵时间为20～26 d。

图5 发酵过程中牛蒡复合果蔬酵素的抗氧化性变化Fig.5 Changes of antioxidant activity of burdock compound fruit and vegetable Jiaosu during fermentation

2.3.3 牛蒡复合果蔬酵素的理化指标及感官评价

牛蒡复合果蔬酵素发酵49 d后，发酵液中总酸含量为（4.78±0.59）mg/mL，pH值为（3.32±0.42），可溶性固形物含量为（5.27±0.71）%，酒精度为（1.50±0.73）%vol。发酵产品颜色呈淡黄褐色，基本透明，口感清爽微酸，具有略带青椒气味的果蔬风味。

3 结论

以超氧化物歧化酶（SOD）活性为评价指标，分别进行单因素试验和Box-Behnken响应面试验设计优化其发酵工艺。结果表明，最佳发酵工艺条件为：发酵温度32 ℃，发酵时间26 d，接种量2.5%，在该条件下，SOD活性达（52.09±1.02）U/mL。延长发酵时间至49 d，其功能酶（SOD、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）活性和DPPH、ABTS、羟自由基清除率变化均呈先上升后下降的趋势。当发酵完成后，总酸、可溶性固形物、酒精度分别为（4.78±0.59）mg/mL、（5.27±0.71）%、（1.50±0.73）%vol，呈淡黄褐色，口感清爽微酸。相比自然发酵酵素动辄以月、年为单位的长周期，以天为单位的控制发酵是具有一定可行性的，能极大降低工业化发酵生产中时间成本和贮存压力。