施氮对现蕾期和开花期甜菊生长及甜菊糖苷的影响

孙玉明, 张 婷, 徐晓洋, 杨永恒, 张永侠, 徐敏月, 原海燕,①

〔1. 江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园), 江苏 南京 210014;2. 江苏省骆运水利工程管理处, 江苏 宿迁 223800〕

甜菊(SteviarebaudianaBertoni)，又名甜叶菊，为菊科(Asteraceae)甜菊属(SteviaCav.)多年生草本植物，由于其叶片中富含的甜菊糖苷具有潜在药用价值而备受关注。甜菊糖苷是包括甜菊苷、莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷C等在内的、由多种四环二萜类化合物组成的一类化合物。甜菊糖苷具有高甜度、低热量的特征，并在降血糖、降血脂、预防龋齿以及提高人体免疫力等方面具有重要功能[1-3]。上述特点极力推动了甜菊糖苷在医疗和食品领域的应用以及甜菊商业化栽培的进程。

氮素是影响植物生长发育和生理过程的关键营养元素，增施氮肥可以显著提高甜菊叶片光合碳同化速率以及干质量形成[4,5]。氮素还会直接影响植物初级代谢与次级代谢平衡，并在甜菊糖苷合成中发挥调节作用。目前，大多数研究认为增施氮肥会降低甜菊叶片中甜菊糖苷总含量[5-7]，但是也有部分研究发现氮肥投入与叶片甜菊糖苷含量之间存在正相关关系[4,8]或无显著相关关系[9,10]。甜菊糖苷含量对氮素的差异响应可能与土壤肥力、氮肥投入水平以及甜菊基因型等因子有关，并且最新研究发现，氮素对甜菊糖苷合成的影响可能与“生长-分化权衡”及叶片碳代谢重编程有关[11]。

生育期也是影响植物生长和代谢的关键因子，并且植物生育期进程和生理过程也会受到氮素的影响[12]。舒世珍[13]认为，甜菊叶片中的甜菊糖苷含量在现蕾期达到最高，进入开花期后，甜菊生长缓慢、枯叶掉落并且叶片中甜菊糖苷含量下降。因此，在甜菊实际生产中，通常将现蕾期定义为农艺收获的最佳时期。然而，目前鲜有研究关注甜菊现蕾期与开花期甜菊叶片甜菊糖苷含量的变化规律，并且关于氮素对现蕾期和开花期甜菊生长和叶片甜菊糖苷合成的影响尚不清楚。

本研究选取甜菊品种‘中山8号’(‘Zhongshan No. 8’)作为研究对象，通过比较不同施氮处理下不同生育期(现蕾期和开花期)甜菊不同器官干质量、氮素吸收累积、全碳和可溶性糖含量以及叶片甜菊糖苷含量和累积量的变化，旨在明确施氮影响不同生育期甜菊叶片中甜菊糖苷含量变化的生理机制，并为确定高产优质甜菊的收获时间及相应施氮管理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为江苏省中国科学院植物研究所自主选育的甜菊品种‘中山8号’1年生扦插苗，实验地位于江苏省中国科学院植物研究所试验基地。实验地耕作层土壤中有机质含量34.24 mg·g-1、全氮含量3.28 mg·g-1、速效磷含量57.84 mg·kg-1及速效钾含量261.72 mg·kg-1，pH 7.21。

1.2 实验设计

设置不施氮(N0)和施氮(N1)2个处理，每个处理设置3个小区作为重复，每个小区面积1.25 m×2.00 m。于2020年5月30日移栽长势基本一致的甜菊扦插苗，每个小区移栽12株。基于前期研究[14]，施氮处理每小区施尿素163.0 g(折合氮300 kg·hm-2)，按照质量比5∶3∶2依次作为基肥、分枝肥和促花肥分次施用。每个小区均施磷酸钙156.0 g和氯化钾37.5 g(分别折合五氧化二磷75 kg·hm-2和氧化钾90 kg·hm-2)，作为基肥一次性施入。分别在现蕾期(8月30日)和开花期(9月15日)采样，每个小区每次取1株甜菊幼苗，将样品带回实验室处理后用于各项指标的测定。

1.3 方法

1.3.1 甜菊干质量测定 用蒸馏水将甜菊植株冲洗干净，然后将叶片、茎和花分离，分别放置在105 ℃烘箱中杀青30 min后再置于70 ℃烘箱中烘干至恒质量。使用JJ1000型百分之一电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)称量并记录，然后用研钵将样品均匀研磨，置于自封袋中，于干燥处储存，待测。

1.3.2 全氮、全碳和可溶性糖含量的测定 参照鲍士旦[15]的方法，采用H2SO4-H2O2高温消解并使用凯氏定氮法测定全氮含量;根据公式“氮素累积量=各器官干质量×相应器官全氮含量”和“氮素分配比例=(各器官氮素累积量/所有器官氮素累积量之和)×100%”分别计算甜菊各器官的氮素累积量和氮素分配比例；参照Shaw[16]的方法，采用重铬酸钾-浓硫酸外加热并通过滴定法测定全碳含量；根据公式“碳氮比=各器官全碳含量/相应器官全氮含量”计算甜菊各器官的碳氮比；采用蒽酮比色法[17]测定可溶性糖含量。

1.3.3 叶片甜菊糖苷的提取及测定 参照文献[18]的方法，提取和测定甜菊叶片中甜菊糖苷含量，计算总甜菊糖苷含量和单株总甜菊糖苷累积量。

1.4 数据分析

利用EXCEL 2010软件处理实验数据，利用SPSS 16.0软件进行方差分析，并采用Duncan’s多重比较法进行显著性分析，利用SPSS 16.0软件进行Pearson相关性分析。

2 结果和分析

2.1 施氮对现蕾期和开花期甜菊干质量的影响

施氮对现蕾期和开花期甜菊不同器官干质量的影响见表1。由表1可以看出：与不施氮处理相比，施氮处理中，现蕾期甜菊茎、叶片和地上部干质量显著增加，分别增加了149.23%、126.24%和141.15%；开花期甜菊茎、叶片、花和地上部干质量总体上显著增加，分别增加了39.44%、64.18%、57.27%和48.65%。同一施氮水平下，开花期甜菊茎、叶片和地上部干质量明显高于现蕾期。方差分析结果显示：施氮水平和生育期对甜菊不同器官干质量有显著或极显著影响，但二者的交互作用对甜菊不同器官干质量均无显著影响。

表1 施氮对现蕾期和开花期甜菊不同器官干质量的影响

2.2 施氮对现蕾期和开花期甜菊全氮含量以及氮素累积量和分配比例的影响

2.2.1 对全氮含量的影响 施氮对现蕾期和开花期甜菊不同器官全氮含量的影响见表2。由表2可以看出：开花期甜菊花中全氮含量最高，现蕾期和开花期甜菊叶片中全氮含量均明显高于茎。与不施氮处理相比，施氮处理中，现蕾期甜菊茎和叶片中全氮含量分别升高了27.81%和28.25%，开花期甜菊茎、叶片和花中全氮含量分别升高了27.77%、19.28%和18.61%，其中，现蕾期和开花期施氮处理甜菊叶片中全氮含量显著高于不施氮处理。同一施氮水平下，甜菊茎和叶片中全氮含量在不同生育期间无显著差异。方差分析结果显示：施氮水平对甜菊茎和叶片中全氮含量有显著或极显著影响，对花中全氮含量无显著影响；生育期对甜菊茎中全氮含量有显著影响，但是对叶片中全氮含量无显著影响；施氮水平与生育期的交互作用对甜菊茎和叶片中全氮含量均无显著影响。

表2 施氮对现蕾期和开花期甜菊不同器官中全氮含量的影响

2.2.2 对氮素累积量和分配比例的影响 施氮对现蕾期和开花期甜菊不同器官中氮素累积量和分配比例的影响见表3。由表3可以看出：与不施氮处理相比，现蕾期和开花期施氮处理甜菊同一器官中氮素累积量均显著升高，其中，现蕾期甜菊茎、叶片和地上部中氮素累积量分别升高了216.41%、186.69%和198.61%，开花期甜菊茎、叶片、花和地上部中氮素累积量分别升高了82.04%、107.33%、92.96%和94.61%。不施氮处理中，与现蕾期相比，开花期甜菊茎和地上部中氮素累积量显著升高，而叶片中氮素累积量无显著变化；施氮处理中，与现蕾期相比，开花期甜菊茎和叶片中氮素累积量无显著变化，而地上部中氮素累积量显著升高。方差分析结果显示：施氮水平和生育期对甜菊不同器官中氮素累积量有显著或极显著影响，但二者的交互作用对甜菊不同器官中氮素累积量均无显著影响。

由表3还可以看出：现蕾期甜菊氮素主要分配在叶片中；开花期甜菊叶片中氮素分配比例最大，茎中氮素分配比例次之，花中氮素分配比例最小。同一施氮水平下，与现蕾期相比，开花期甜菊叶片中氮素分配比例显著降低，茎中氮素分配比例也有所降低，但无显著变化。方差分析结果显示：仅生育期对甜菊叶片中氮素分配比例有极显著影响，施氮水平以及施氮水平与生育期的交互作用对甜菊茎和叶片中氮素分配比例均无显著影响。

表3 施氮对现蕾期和开花期甜菊不同器官中氮素累积量和分配比例的影响

2.3 施氮对现蕾期和开花期甜菊全碳含量、碳氮比及可溶性糖含量的影响

施氮对现蕾期和开花期甜菊不同器官中全碳含量、碳氮比及可溶性糖含量的影响见表4。由表4可以看出：同一生育期施氮与不施氮处理间及同一施氮水平现蕾期与开花期间甜菊各器官中的全碳含量均无显著变化。方差分析结果表明：施氮水平和生育期及二者的交互作用对甜菊不同器官中全碳含量均无显著影响。

由表4还可以看出：与不施氮处理相比，施氮处理中，现蕾期甜菊茎和叶片中碳氮比分别降低了20.07%和23.11%，开花期甜菊茎、叶片和花中碳氮比分别降低了22.91%、18.61%和16.00%，其中，现蕾期和开花期施氮处理甜菊叶片中碳氮比显著低于不施氮处理。方差分析结果显示：施氮水平对甜菊茎和叶片中碳氮比有显著或极显著影响，但对花中碳氮比无显著影响；生育期对甜菊茎中碳氮比有显著影响，但对叶片中碳氮比无显著影响；施氮水平与生育期的交互作用对甜菊茎和叶片中碳氮比均无显著影响。

由表4还可以看出：与不施氮处理相比，施氮处理中，现蕾期甜菊茎中可溶性糖含量显著升高，开花期甜菊茎和花中可溶性糖含量有所升高，但无显著变化；现蕾期和开花期甜菊叶片中可溶性糖含量分别降低了8.15%和16.40%。不施氮处理中，与现蕾期相比，开花期甜菊茎中可溶性糖含量显著升高，而叶片中可溶性糖含量显著降低；施氮处理中，与现蕾期相比，开花期甜菊茎中可溶性糖含量无显著变化，叶片中可溶性糖含量显著降低。方差分析结果表明：施氮水平和生育期对甜菊茎和叶片中可溶糖含量均有显著或极显著影响，但是施氮水平与生育期的交互作用对甜菊茎和叶片中可溶性糖含量无显著影响。

2.4 施氮对现蕾期和开花期甜菊叶片甜菊糖苷含量及累积量的影响

施氮对现蕾期和开花期甜菊叶片甜菊糖苷含量及累积量的影响见表5。由表5可以看出：与不施氮处理相比，施氮处理中，现蕾期甜菊叶片中甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C和总甜菊糖苷含量显著降低，分别降低了15.82%、59.56%、51.32%和46.56%；开花期甜菊叶片中甜菊苷、莱鲍迪苷C和总甜菊糖苷含量显著降低，分别降低了31.31%、44.12%和25.64%，莱鲍迪苷A含量无显著变化。与现蕾期相比，不施氮处理中开花期甜菊叶片中莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C和总甜菊糖苷含量显著降低，甜菊苷含量无显著变化；施氮处理中开花期甜菊叶片中甜菊苷和莱鲍迪苷C含量显著降低，莱鲍迪苷A和总甜菊糖苷含量无显著变化。方差分析结果表明：施氮水平和生育期对甜菊叶片中各甜菊糖苷含量均有极显著影响，施氮水平与生育期的交互作用对莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C和总甜菊糖苷含量有显著或极显著影响，对甜菊苷含量的影响不显著。

表4 施氮对现蕾期和开花期甜菊不同器官中全碳含量、碳氮比及可溶性糖含量的影响

表5 施氮对现蕾期和开花期甜菊叶片中甜菊糖苷含量及累积量的影响

由表5还可以看出：在同一生育期，与不施氮处理相比，施氮处理甜菊单株总甜菊糖苷累积量有所升高，但差异未达到显著水平。方差分析结果表明：施氮水平和生育期及二者的交互作用对甜菊单株总甜菊糖苷累积量无显著影响。

2.5 甜菊叶片中总甜菊糖苷含量及其他因子间的相关性分析

甜菊叶片中总甜菊糖苷含量及其他因子间的Pearson相关系数见表6。由表6可以看出：甜菊叶片中总甜菊糖苷含量与全氮含量和干质量间分别呈显著和极显著负相关关系，与碳氮比和可溶性糖含量间分别呈显著和极显著正相关关系，与全碳含量无显著相关关系。此外，甜菊叶片干质量与全氮含量间呈极显著正相关关系，但是与碳氮比和可溶性糖含量分别呈极显著和显著负相关关系。

表6 甜菊叶片中总甜菊糖苷含量及其他因子间的Pearson相关系数1)

3 讨论和结论

作为氨基酸、酶以及核酸等物质的重要组成成分，氮素是植物生长和代谢过程中必需的大量营养元素，并在农业生产中发挥着不可或缺的作用。研究结果表明：氮素缺失会导致植物氮代谢过程受到抑制、叶片光合速率下降、叶绿素降解以及发育迟缓等问题，进而限制作物产量[19,20]。本研究中，与不施氮相比，增施氮肥总体上显著提高甜菊的氮素吸收累积并促进干质量形成。此外，与现蕾期相比，施氮对开花期甜菊叶片全氮含量无显著影响但是导致叶片中氮素分配比例显著降低，这主要是由于花器官发育导致植物源库关系发生变化。

植物代谢进程及作物品质形成受到氮素的调控。研究结果表明：增加氮素供应通常会促进植物体内氨基酸、蛋白质以及含氮生物碱的生物合成，但是对植物体内碳基次级代谢产物如酚类和萜类化合物合成产生负面影响[21-24]。甜菊糖苷是决定甜菊品质和经济价值的一类萜类化合物。本研究结果显示：与不施氮相比，施氮会抑制现蕾期和开花期甜菊叶片中不同甜菊糖苷组分的含量。矿质营养对碳基次级代谢产物合成的调控与植物“生长-分化权衡”以及生物量引起的“稀释效应”有关[21,25]。这2种机制在氮营养背景下并不冲突，即在氮充足条件下，植物优先促进生长和生物量形成，因而导致了对碳基次级代谢过程的抑制或相对“稀释”。本研究中，施氮对甜菊叶片全氮含量和碳氮比的影响显著高于茎，表明叶片碳氮代谢对土壤氮素水平变化的敏感性[21]，同时也强调了氮肥管理在以叶片为主要收获器官的甜菊生产中的重要性。本研究发现，甜菊叶片可溶性糖含量和总甜菊糖苷含量均受到施氮处理的负调控且叶片可溶性糖含量与总甜菊糖苷含量之间存在极显著正相关关系。高氮供应对植物可溶性糖含量及碳基次级代谢产物的协同负调控作用也在卡琪花蒂玛(LabisiapumilaBenth.)[26]和杭白菊(Chrysanthemum×morifoliumRamat.)[27]的相关研究中得到印证。上述结果表明：可溶性糖作为碳基次级代谢产物合成底物，在甜菊糖苷对氮素响应中发挥决定性作用[28,29]。

生育期是影响植物生长发育和生理代谢的关键因子。已有研究结果表明：从苗期到现蕾期，甜菊叶片中甜菊糖苷含量随营养生长进程逐渐增加，但是在甜菊开花后出现不同程度的下降[30,31]。Yang等[32]通过室内试验发现，与现蕾期相比，开花后甜菊叶片中甜菊糖苷含量及甜菊糖苷合成相关基因的表达水平显著降低。本研究中，在施氮和不施氮处理中，开花期甜菊叶片不同甜菊糖苷组分含量均较现蕾期出现不同程度的降低，再次表明现蕾期是甜菊叶片收获的最佳时期。生育期还极显著影响甜菊叶片氮素分配比例和可溶性糖含量，这表明甜菊开花后源库关系发生变化，甜菊向花器官转移营养物质以促进花器官发育[33]，这会导致叶片可溶性糖含量的降低并抑制甜菊糖苷合成。此外，氮素也可以通过调控源库关系影响开花期甜菊碳代谢。研究表明：增施氮肥会通过增加生殖器官(如花和果实)的大小促进库容，并促进光合碳同化产物(可溶性糖)从营养器官向生殖器官转运[34]。因此，甜菊开花期较高的叶片氮素水平会促进碳氮物质向花器官转运，并对叶片可溶性糖及甜菊糖苷含量产生进一步的负面影响。

环境条件导致的生物量变化会“权衡”作物品质，并对作物产量及品质综合调控有重要影响。例如：在大气CO2浓度升高或土壤水分含量降低等环境条件下，小麦(TriticumaestivumLinn.)和牧草的产量和品质之间也存在“权衡”关系[35,36]。甜菊叶片中总甜菊糖苷累积量并未受到施氮水平和生育期的显著影响，这是叶片干质量增加及甜菊糖苷含量降低的“权衡”结果。

综上所述，施氮水平和生育期均会影响甜菊生长和叶片甜菊糖苷含量。与现蕾期相比，开花期甜菊叶片中可溶性糖和甜菊糖苷含量均显著降低，增施氮肥会促进可溶性糖向花器官转运并进一步加剧花后甜菊叶片中甜菊糖苷含量的降低。因此，在甜菊实际生产过程中，应在甜菊现蕾期及时采收叶片，同时减少甜菊生育后期的氮肥投入以减少叶片可溶性糖向花器官转运。