基于光合色素含量和叶绿素荧光参数的杞柳叶片Cd积累能力预测

王树凤， 王 松， 舒婉钦，3， 陈光才，①

(1． 中国林业科学研究院亚热带林业研究所， 浙江 杭州 311400； 2. 台州市林业技术推广总站， 浙江 台州 318000；3． 中南林业科技大学林学院， 湖南 长沙 410004)

镉(Cd)是生物毒性极强的重金属元素之一，土壤中的Cd很容易被植物根系吸收并转运到地上部，进入食物链，导致动物或人类产生多种疾病[1,2]。植物Cd含量不仅关系食品安全，而且可以预测土壤重金属污染程度，是利用植物对重金属污染土壤进行修复的基础[3,4]。采用常规化学方法检测植物重金属含量，虽然准确性好、灵敏度高，但也存在破坏性取样、测试周期长、化学试剂消耗量大等缺点，无法实现植物重金属积累能力的快速判断。因此，探索并建立快速、有效评估植物重金属积累能力的方法，对筛选高效修复植物以及预测土壤重金属污染程度具有重要意义[5,6]。

目前，植物中重金属含量监测或预测的方法大多基于植物叶片或植被反射光谱建立，国内外针对多种农作物和草本植物建立了各种光谱反演模型用于监测或预测植物中重金属含量[3-6]。光谱数据的测定多应用于农业遥感等领域，在大尺度监测土壤重金属污染和植物重金属含量方面具有无可比拟的优点。然而，光谱反演模型中反射率的信号除了来自目标植物本身，还包含了土壤和杂草等混合信号，在监测和预测过程中产生不稳定性[7]，而且大多缺乏与植物内在遗传和生理特征的关联[7,8]，无法满足对植物重金属积累能力和生理响应的准确判断。此外，当前大多数光谱反演模型是基于农作物建立的，针对木本植物的模型很少[9,10]。因此，除了进一步扩展光谱反演模型的应用范围，还有必要同时从多角度，特别是植物生理特征等方面探索木本植物重金属含量预测方法。

对重金属光谱反演模型的参数分析发现，植物对重金属污染敏感的波段大多集中在可见光-红边波段，其中波长350～716 nm是表征叶片色素的波段[11]。叶绿素含量和叶绿素荧光参数是表征植物光合作用和生长状况的重要指标，在农业上被广泛用于农作物的营养状况和产量监测[8,12]。如：利用叶绿素荧光图像预测辣椒(CapsicumannuumLinn.)叶片氮含量，用于监测辣椒生长过程中的营养状况[13]；衡亚蓉等[8]应用小麦(TriticumaestivumLinn.)上部叶片叶绿素荧光参数进行产量预测和评价。此外，叶绿素含量和叶绿素荧光参数对环境胁迫具有极高的敏感性，可用于监测环境污染[14]和植物受胁迫等级[15]等方面。通过监测重金属胁迫下叶片的叶绿素含量变化，可以确定重金属胁迫水平，从而实现对土壤重金属污染的监测[14]。但在评价和预测植物重金属含量方面，目前大多数研究的关注点在重金属胁迫对叶片叶绿素含量及叶绿素荧光参数的影响[9]，对叶片重金属含量与叶绿素含量和叶绿素荧光参数间相关性的研究不足。相关研究结果[16]表明：树木叶片Mn的积累能力与叶绿素荧光参数有关，其中PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)可反映叶片Mn含量和毒性。上述研究证实，叶片叶绿素含量和叶绿素荧光参数与叶片矿质元素含量间存在必然的相关性。基于此，作者推测植物叶片中重金属含量可能与叶绿素含量及叶绿素荧光参数间存在一定相关性。因此，本文以研究基础较好的杞柳(SalixintegraThunb.)[17,18]不同品种为材料，研究不同浓度Cd处理下叶片光合色素含量和叶绿素荧光参数的变化，分析叶片Cd含量与光合色素和叶绿素荧光参数间的相关性，探讨基于光合色素含量和叶绿素荧光参数预测叶片Cd积累能力的可行性，为快速、有效评价杞柳地上部Cd积累能力提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为杞柳4个品种‘大红头’(‘Dahongtou’)、‘一枝笔’(‘Yizhibi’)、‘黄皮柳’(‘Huangpiliu’)和‘庄坞柳’(‘Zhuangwuliu’)，材料均来自山东省鱼台县清河镇杞柳种植基地(东经116°50′、北纬35°10′)，其中，‘大红头’和‘一枝笔’对Cd具有较高的耐性和积累能力[17,18]。

1.2 方法

1.2.1 材料培养 试验在中国林业科学研究院亚热带林业研究所(东经119°95′、北纬30°05′)试验大棚内进行。于2019年3月，剪取杞柳1年生枝条(长度约15 cm，直径1.0～1.5 cm)，扦插于15 L塑料盆(长50 cm、宽35 cm、高15 cm)中的泡沫板上(株距和行距均为5 cm)，扦插后采用自来水培养3周，之后更换为Watson等[19]改进的营养液(pH 5.5)进行预培养，连续不断充气，整个试验期间采用自然光照(光照时间11～13 h·d-1)，温度15 ℃～27 ℃。

1.2.2 试验设计 扦插苗在营养液中预培养1周后，选取生长基本一致的苗木进行CdCl2处理。根据前期研究结果[18]设置对照(0 μmol·L-1CdCl2)、低浓度Cd处理(10 μmol·L-1CdCl2)和高浓度Cd处理(50 μmol·L-1CdCl2)3个处理组。每个处理3盆(每盆即为1个重复)，每盆20株苗木，每个品种5个单株，4个品种共计180株苗木。每周更换营养液2次，培养21 d。

1.2.3 叶绿素荧光图像采集 苗木经CdCl2处理21 d后，选取植株从上至下第5至第7枚功能叶片并标记，然后对标记的功能叶片进行叶绿素荧光图像参数的采集。

使用IMAGING-PAM叶绿素荧光成像系统(德国Walz公司)采集叶绿素荧光图像。首先对标记的功能叶片暗适应30 min，测量光、光化光、饱和脉冲光强度分别设置为20、55和280 μmol·m-2·s-1。测量程序采用Imaging Win软件内置的动力学曲线模式，测量完成后，对获得的荧光图像进行分析并获取最大荧光(Fm)、初始荧光(Fo)、PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ实际光量子产额〔Y(Ⅱ)〕、调节性能量耗散的量子产额〔Y(NPQ)〕、非调节性能量耗散的量子产额〔Y(NO)〕、非光化学淬灭系数(qN)、光化学淬灭系数(qP)和相对光合电子传递速率(rETR)。采集叶绿素荧光图像后，将标记的功能叶片分为2份，一份用于测定光合色素含量，另一份用于测定Cd含量。

1.2.4 光合色素含量测定 称取0.5 g新鲜叶片，在研钵中加入液氮研磨至粉末，加入20 mL体积分数80%丙酮提取色素，使用TU-1810紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)测定提取液在波长663、645和 470 nm处的吸光度，然后根据Wellburn[20]的公式计算叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素以及类胡萝卜素含量。

1.2.5 叶片Cd含量测定 新鲜叶片于105 ℃杀青30 min，75 ℃烘干至恒质量，粉碎。准确称取0.2 g样品粉末，加入10 mL HNO3-HClO4(体积比4∶1)混合液消解，然后使用ICAP-7400电感耦合等离子体发射光谱仪(美国ThermoFisher公司)测定叶片Cd含量[21]。

1.3 数据处理和分析

采用SPSS 20.0软件对叶片光合色素含量、叶绿素荧光参数以及叶片Cd含量等14个指标进行双因素方差分析以及LSD多重比较检验，采用OriginLab 2018软件作图。采用R语言cor ()、corplot () 函数对14个指标进行Pearson相关性分析及作图，选取相关性极强的指标构建回归模型；采用 step AIC () 函数进行逐步回归，并依据赤池信息量准则(Akaike information criterion, AIC)进行参数选择，选出与叶片Cd含量最相关的X值带入模型，利用R语言中的car包进行回归模型诊断和检验[22]。

2 结果和分析

2.1 Cd对杞柳叶片光合色素含量的影响

双因素方差分析结果(表1)显示：品种对杞柳叶片光合色素含量的影响不显著，但Cd处理对光合色素含量均有极显著(P<0.01)影响，二者的交互作用对叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素以及类胡萝卜素含量有显著(P<0.05)或极显著影响。说明在不同浓度Cd处理下，杞柳叶片光合色素的响应存在基因型差异。

在现场对断路器垂直连杆进行了清洗、润滑，并更换整套垂直连杆轴密封件。随后，对断路器机械特性参数进行了重新测量，测试数据如表3所示，机械特性曲线如图6所示。从测试数据看出，检修以后，该断路器的机械特性参数皆满足厂家技术标准要求。

不同浓度Cd处理对杞柳不同品种叶片光合色素含量的影响见图1。结果显示：随着Cd浓度提高，‘大红头’、‘一枝笔’、‘黄皮柳’和‘庄坞柳’4个品种叶片光合色素含量均呈下降趋势，但低浓度Cd处理(10 μmol·L-1CdCl2)下，‘一枝笔’叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量下降不显著，其中，叶绿素b含量仅较对照(0 μmol·L-1CdCl2)降低了2.89%；其他3个品种在低浓度Cd处理下叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素以及类胡萝卜素含量总体显著(P<0.05)下降，其中，‘庄坞柳’叶片4种色素含量较对照降低了42.98%～59.71%。在高浓度Cd处理(50 μmol·L-1CdCl2)下，‘一枝笔’叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素以及类胡萝卜素含量均低于其他品种，且与低浓度Cd处理间有显著差异，而其他3个品种叶片4种色素含量在低浓度和高浓度Cd处理间总体差异不显著，其中，‘黄皮柳’叶片4种色素含量较对照降低了10.24%～13.54%。说明杞柳叶片光合色素含量对Cd浓度的敏感性存在品种差异，‘一枝笔’叶片光合色素对低浓度Cd处理不敏感，可以维持相对较高的色素含量，但对高浓度Cd的耐性不及‘大红头’、‘黄皮柳’和‘庄坞柳’。

表1 品种和Cd处理对杞柳叶片光合色素含量影响的双因素方差分析1)

: ‘大红头’‘Dahongtou’; : ‘一枝笔’‘Yizhibi’; : ‘黄皮柳’‘Huangpiliu’; : ‘庄坞柳’‘Zhuangwuliu. 同一品种不同小写字母表示在不同浓度Cd处理间差异显著(P<0.05) Different lowercases of the same cultivar indicate the significant (P<0.05) difference among Cd treatments with different concentrations.

2.2 Cd对杞柳叶片叶绿素荧光参数的影响

双因素方差分析结果(表2)显示：品种仅对杞柳叶片Fm、Fo、Fv/Fm和qN值有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)影响，Cd处理对叶绿素荧光参数均有极显著影响，二者的交互作用对Fv/Fm、Y(Ⅱ)、Y(NPQ)、Y(NO)、qP和rETR值有极显著影响，对Fm、Fo和qN值的影响不显著。

Fm和Fo值是反映植物在开始进行光合作用之前的背景值，因此，本文仅分析Cd处理对其余7个叶绿素荧光参数的影响，结果见图2和表3。结果(图2)显示：与对照(0 μmol·L-1CdCl2)相比，4个品种叶片的Fv/Fm值在低浓度(10 μmol·L-1CdCl2)和高浓度(50 μmol·L-1CdCl2)Cd处理下均显著降低，但不同品种叶片的Fv/Fm值对不同Cd浓度的响应不同，‘大红头’叶片的Fv/Fm值在低浓度和高浓度Cd处理间差异不显著，而其他3个品种叶片的Fv/Fm值随着Cd浓度的提高显著降低。说明Cd处理明显抑制了杞柳叶片光合作用，导致PSⅡ最大光化学效率下降。‘大红头’、‘一枝笔’和‘庄坞柳’叶片qN值随着Cd处理浓度提高呈升高的趋势；而‘黄皮柳’叶片qN值在低浓度和高浓度Cd处理下较对照显著降低。‘大红头’、‘一枝笔’和‘庄坞柳’叶片qP值在低浓度Cd处理下显著降低，但在高浓度Cd处理下与对照无显著差异；而‘黄皮柳’叶片qP值在低浓度Cd处理下与对照差异不显著，但在高浓度Cd处理下显著降低。说明Cd处理并未导致‘黄皮柳’叶片明显的光损伤；虽然Cd处理对‘大红头’、‘一枝笔’和‘庄坞柳’造成了一定程度的光损伤，但由于相应的热耗散也增加，植物仍有能力消耗过剩的光能。同时发现，Cd处理抑制了‘大红头’、‘一枝笔’和‘庄坞柳’叶片的rETR值，导致rETR值在低浓度和高浓度Cd处理下均显著降低；而‘黄皮柳’叶片rETR值仅在高浓度Cd处理下显著降低。

表2 品种和Cd处理对杞柳叶片叶绿素荧光参数影响的双因素方差分析1)

: ‘大红头’‘Dahongtou’; : ‘一枝笔’‘Yizhibi’; : ‘黄皮柳’‘Huangpiliu’; : ‘庄坞柳’‘Zhuangwuliu. 同一品种不同小写字母表示在不同浓度Cd处理间差异显著(P<0.05) Different lowercases of the same cultivar indicate the significant (P<0.05) difference among Cd treatments with different concentrations.

表3 Cd处理下杞柳不同品种叶片PSⅡ反应中心的能量分配策略1)

rETR值的降低必然对PSⅡ反应中心的能量分配产生影响，Cd处理下4个品种叶片PSⅡ反应中心的能量分配策略(表3)显示：随着Cd浓度提高，‘大红头’、‘一枝笔’和‘庄坞柳’叶片Y(NPQ)和Y(NO)值均有不同程度的升高，说明这3个品种在Cd处理下光能出现过剩，光保护能力增强；而‘黄皮柳’叶片Y(NPQ)和Y(NO)值变化不大，说明‘黄皮柳’在Cd处理下受到的光损伤相对较小。同时发现，Cd处理导致4个品种叶片Y(Ⅱ)值有不同程度降低，但4个品种在Cd处理下的Y(Ⅱ) 值仍达到0.540～0.630，说明PSⅡ反应中心仍然具有较高的活性，有超过一半的光量子通过光化学途径转化为能量。

2.3 杞柳不同品种叶片Cd积累能力差异

双因素方差分析结果(表4)显示：品种对杞柳叶片Cd含量有显著(P<0.05)影响，Cd处理对叶片Cd含量有极显著(P<0.01)影响，二者的交互作用对叶片Cd含量的影响不显著。

表4 品种和Cd处理对杞柳叶片Cd含量影响的双因素方差分析1)

不同浓度Cd处理对杞柳不同品种叶片Cd含量的影响见图3。结果显示：随着Cd浓度提高，4个品种叶片Cd含量逐渐升高。与低浓度(10 μmol·L-1CdCl2)Cd处理相比，‘大红头’和‘一枝笔’叶片Cd含量在高浓度(50 μmol·L-1CdCl2)Cd处理下显著升高，而‘黄皮柳’和‘庄坞柳’叶片Cd含量在2个处理间差异不显著。通过对η2值的分析也发现，环境Cd浓度可以解释绝大部分的叶片Cd含量变异(η2值为0.947)，而品种对叶片Cd含量变异的解释度较小(η2值为0.298)。说明环境对杞柳叶片Cd含量的影响要大于基因型的影响。

: ‘大红头’‘Dahongtou’; : ‘一枝笔’‘Yizhibi’; : ‘黄皮柳’‘Huangpiliu’; : ‘庄坞柳’‘Zhuangwuliu. 同一品种不同小写字母表示在不同浓度Cd处理间差异显著(P<0.05) Different lowercases of the same cultivar indicate the significant (P<0.05) difference among Cd treatments with different concentrations.

2.4 基于光合色素含量及叶绿素荧光参数构建杞柳叶片Cd积累能力评价模型

相关性分析结果显示：叶片Cd含量与叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量以及Fm、Fo、Fv/Fm、Y(Ⅱ)、Y(NPQ)、Y(NO)、qN、qP和rETR值的相关系数分别为-0.910、-0.837、-0.896、-0.866、-0.618、0.830、-0.866、-0.497、0.333、0.534、0.734、0.007和-0.496；且叶片Cd含量与光合色素含量以及除qP值外的其他叶绿素荧光参数均存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)相关性。

选取与叶片Cd含量的相关系数绝对值大于0.8的6个因子作为预测变量，包括叶绿素a含量(X1)、叶绿素b含量(X2)、总叶绿素含量(X3)、类胡萝卜素含量(X4)、Fo值(X5)和Fv/Fm值(X6)，以叶片Cd含量为因变量(Y)，采用多元逐步回归法进行拟合，每次拟合根据贡献值排除1个变量，初始的AIC值为300.08，随着变量的依次排除，AIC值逐渐减小(298.10～292.38)，最终基于Fv/Fm值(X6)和叶绿素a含量(X1)2个变量构建回归模型(表5)。根据未标准化回归系数(偏回归系数)，发现叶片叶绿素a含量对叶片Cd含量的影响大于Fv/Fm值，模型表达式为Y=1 928.761-128.842X1-2 005.500X6(R2=0.850)。检验结果(图4)显示：叶片Cd含量的预测值与测定值间呈极显著正相关，相关系数达0.941 2，说明本研究建立的模型具有较好的预测价值。

表5 回归模型参数及方差分析结果

图4 基于预测模型对杞柳叶片Cd含量的预测检验

3 讨论和结论

Cd胁迫下叶片失绿是植株最明显的症状之一[23,24]。研究表明：Cd导致植物叶片失绿最直接的原因是由于Cd可以替代叶绿素分子中的Mg，形成脱镁叶绿素，从而破坏叶绿素分子结构，导致叶绿素降解、叶片失绿[25]。本研究中，不同浓度Cd处理(10和50 μmol·L-1CdCl2)均可导致杞柳4个品种叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素以及类胡萝卜素含量不同程度的下降，且下降程度随Cd浓度的提高而增加，这与当前大部分研究结果一致。相关研究结果[26]发现，白柳(SalixalbaLinn.)不同无性系在50 μmol·L-1CdSO4处理条件下，叶绿素a和叶绿素b以及总叶绿素含量均有不同程度下降，而且叶绿素a含量比叶绿素b含量下降幅度更大，导致叶绿素a/b比值明显下降。本研究也发现，Cd处理下，杞柳叶片叶绿素a含量的下降幅度大于叶绿素b含量，特别是‘一枝笔’，在低浓度Cd处理下，叶绿素b含量与对照无显著差异，说明低浓度Cd处理并未明显引起‘一枝笔’叶片叶绿素b含量的降解。Kummerová等[27]发现，Cd胁迫下，叶绿素a比叶绿素b具有更快的降解速率。由此可见，叶绿素a对Cd胁迫可能具有更高的敏感性。相关性分析结果显示：杞柳叶片的叶绿素a含量与叶片Cd含量的相关系数达-0.910，具有极显著(P<0.01)负相关关系。类似的结果也在其他树种中发现，Doganlar等[28]发现，在污染环境中生长的夹竹桃(NeriumoleanderLinn.)叶片的叶绿素含量与Fe、Pb和Zn等金属元素含量呈显著负相关。Grajek等[29]采用离体叶绿素分子研究Cd2+对叶绿素降解的影响，发现随着溶液中Cd2+的增加，越来越多的Cd2+替代叶绿素结构中的Mg2+，破坏叶绿素的结构和功能，导致叶绿素含量进一步下降，而这种下降与溶液中Cd2+浓度呈线性关系。因此，推测叶片叶绿素含量下降在一定程度上可以反映叶片Cd浓度的增加。

叶绿素含量变化会影响叶绿素荧光参数，叶绿素荧光参数对重金属极为敏感，已被广泛用于评价植物叶片对重金属的耐性[23,30,31]。黄鑫浩等[30]从能量平衡及分配角度揭示Pb胁迫下木荷(SchimasuperbaGardn. et Champ.)和栾树(KoelreuteriapaniculataLaxm.)PSⅡ运转状况，提出Y(NO)和Y(NPQ)值可作为植物Pb胁迫的评价指标。尽管已有大量研究报道重金属诱导叶绿素荧光参数变化，然而，有关叶绿素荧光参数与叶片重金属含量之间相关性的研究并不多。Kitao等[16]发现，叶绿素荧光参数与叶片Mn的积累能力相关，叶片Mn含量越高，Fv/Fm值越低，Fv/Fm值可作为判断Mn毒性的标准。本研究发现，与对照相比，不同浓度Cd处理导致杞柳4个品种叶片Fv/Fm值均显著下降，且Fv/Fm值与叶片Cd含量呈极显著负相关(相关系数为-0.866)，说明Fv/Fm值低的叶片往往积累更多的Cd。Pietrini等[31]基于叶绿素荧光图像，结合能量色散型X射线荧光(ED-XRF)定点测定，发现白柳SS5叶片坏死斑点具有极低的Fv/Fm值，同时检测到极强的Cd信号，进一步说明叶片Fv/Fm值与Cd含量的相关性。然而，已有研究[26]发现，50 μmol·L-1CdSO4尽管抑制了白柳叶片PSⅡ活性，使Fv/Fm值下降，但并未改变Fo值，认为仅利用Fv/Fm值并不能精确评价白柳不同无性系的Cd耐性程度，这与Pietrini等[23,32]的结论相似。由此可见，在利用叶绿素荧光参数评价植物对重金属的耐性和积累能力时，应考虑多种参数，筛选最敏感或相关性最强的参数进行评价。

Rossi等[33]研究了欧洲油菜(BrassicanapusLinn.)地上部Cd积累量与生物量、光合参数、叶绿素荧光参数等因子的相关性，发现根系鲜质量和Fv/Fm值是影响地上部Cd吸收的主要因子，并据此建立回归模型。基于此，本研究在模型构建过程中，选取了与叶片Cd含量具有极强相关性(相关系数绝对值大于0.8)的6个因子进行拟合，最终建立基于叶绿素a含量和Fv/Fm值的预测模型，且叶片叶绿素a含量对Cd含量的影响大于Fv/Fm值。总体而言，利用该模型对叶片Cd含量进行预测，解释率可达80%以上(R2=0.850)。

综上所述，本研究构建了基于叶绿素a含量和Fv/Fm值的杞柳叶片Cd含量预测模型，为快速筛选和评价杞柳叶片Cd积累能力提供了参考，该模型是对柳属(SalixLinn.)植物叶片Cd含量预测方法的新探索。然而，该模型是基于室内控制条件下建立的，在实际应用过程中，还应进一步扩大使用范围或样本量，如对重金属污染矿区的杞柳叶片Cd含量进行预测，或增加杞柳品种的种类，从而进一步验证模型的有效性并优化模型。