黄芩茎叶-虎杖配伍对急性肺损伤大鼠TRPV1 表达及炎性细胞因子的影响

屈新亮，段广靖，赵 博，谢 锋，王 斌，高 峰，卫培峰，李 敏

（陕西中医药大学药学院，陕西咸阳 712046）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）病理过程较为复杂，通常由多种因素引起，例如感染、创伤、脓毒血症等。患者主要有胸闷、气短、呼吸困难等临床表现，进一步演变可导致急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），病死率达30%～45%［1］。急性肺损伤主要发病机制与炎症反应相关，表现为各种病因诱导肺内促炎因子生成增加，炎症因子的大量释放与激活使肺内炎症反应失控，肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞受损、广泛肺水肿，进一步导致肺部炎性细胞浸润、水肿、气体交换障碍［2］。

黄芩、虎杖为两种传统的中草药，均具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化的药理作用［3-6］。二者发挥清热解毒功效时常配伍联用［7］。黄芩茎叶与黄芩根的药理作用相似，也具有抗炎作用［8］。黄芩茎叶-虎杖相互作用关系尚未明确，对抗炎药效的影响及机制尚未见深入研究，在一定程度上限制其现代化研究与临床应用，因此阐明其配伍作用机制具有重要意义。

瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）是瞬时受体电位（TRP）家族的成员，有研究表明，TRPV1在感染部位被激活后，在减少炎症介质的分泌和抑制炎症反应过程中具有重要的调控作用，从而改善了肺损伤。故本研究将探讨黄芩茎叶-虎杖配伍后对LPS 诱导大鼠ALI 中炎性因子和TRPV1 表达方面的影响及其机制，为临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验药物

黄芩茎叶（黑龙江省大兴安岭）；虎杖饮片（豪州市永刚饮片厂有限公司）。取黄芩茎叶和虎杖药材各100 g，加15 倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮50 min，双层纱布过滤；二煎加10 倍量水，武火煮沸后文火煎煮40 min，过滤，合并两次滤液，浓缩至1 mL 药液含生药1 g，4 ℃以下储存。

1.2 动物

SPF 级健康雄性SD 大鼠48 只（四川实验动物质量检测中心），体质量（150±10）g，6 周龄，生产许可证号：SCXK（川）2020-030，饲养环境为：温度（25±1）℃，相对湿度（50%～60%），自由进食与饮水，动物实验及方法经陕西中医药大学伦理委员会批准。

1.3 试剂

LPS（脂多糖，sigma，货号：L8880）；TNF-α、1L-1β ELISA 试剂盒（上海酶联，货号分别为：ml002859，ml003057）；SOD 活性检测试剂盒（南京建成，货号：A001-3-1）；TRPV1 抗体（武汉博士德，货号：CX0125）；SYBR Green PCR 试剂盒（德国QIAGEN 公 司，货 号：208052）；RNA 提 取 试 剂 盒TRI reagent（美国英杰，货号：15596018）。

1.4 仪器

ELx808 全自动酶标仪（Bio-Tek）、ICX40 倒置显微镜（舜宇光学科技有限公司）、高速冷冻离心机（Thermo）、伯乐电泳仪（BIO RAD）、荧光定量PCR仪（上海罗氏制药）。

1.5 动物造模与分组处理

将48 只SD 雄性大鼠随机分为6 组：对照组、模型组、地塞米松阳性组、黄芩茎叶-虎杖配伍低、中、高剂量组。每组8 只。黄芩茎叶-虎杖配伍低、中、高剂量组分别灌胃3.5、7.0、14.0 g/kg，对照组和模型组给予等量0.9%氯化钠。地塞米松组大鼠腹腔注射5 mg/kg 地塞米松。连续给药7 d，每天给药1次。第8 天除对照组外，其余各组用1 mL 注射器吸取LPS 溶液（配制成1 mg/mL）经大鼠尾静脉注射8 mg/kg 的LPS 诱导ALI 模型。造模6 h 后，将动物麻醉，取腹主动脉血5 mL，分离血清备用，−80 ℃保存。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 大鼠肺组织湿/干质量比值的测定 取新鲜右肺组织，置于超纯水中清洗，吸干水分，称取湿质量。将肺组织置于60 ℃恒温箱干燥，72 h 后，称重得肺干重，根据公式W/D=肺组织湿重/肺组织干重×100%计算湿/干质量（W/D）比值。

1.6.2 大鼠肺组织病理变化 肺组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成薄片（约4 μm），二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，脱蜡，进行苏木精-伊红染色液（HE）染色，于光学显微镜100 倍视野下观察肺组织病理变化。

1.6.3 大鼠相关炎性因子的检测 测定大鼠肺组织中BALF 上清液中的TNF-α、1L-1β 含量。麻醉并结扎右肺，暴露气管行气管插管，分离并结扎右侧主支气管，经气管缓慢注入冷生理盐水，收集BALF，离心，−80 ℃保存。严格按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪（450 nm）读取吸光度OD 值，最终计算出样品的浓度。

1.6.4 大鼠肺组织SOD 的检测 取大鼠血清，按试剂盒说明书测定各组大鼠肺组织中SOD 的水平。

1.6.5 qRT‐PCR 法检测肺组织TRPV1mRNA 表达 采用Trizol 法抽提总RNA，根据试剂盒说明书将RNA 逆转录为cDNA，以cDNA 为模板，β-actin为内参照，使用qRT-PCR 试剂盒和罗氏480Ⅱ型qRT-PCR 仪 检 测TRPV1 的mRNA 水 平。采 用2-ΔΔCT法计算TRPV1 相对表达水平。引物序列见表1。反应条件为95 ℃持续30 s 激活热启动酶，95 ℃变性5 s 和60 ℃延伸30 s，共45 个循环。

表1 引物序列表Tab 1 Primer sequence of TRPV1

1.6.6 Western blot 法检测肺组织中蛋白表达 在肺组织中加入RIPA 裂解液，于匀浆机中研磨，待充分裂解后，离心取上清，取部分上清蛋白用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。将调整的蛋白浓度与等体积5×上样缓冲液混合，于沸水中煮沸5 min 上样，进行SDS‐PAGE 凝胶电泳，200 mA 恒流转膜70/90 min；封闭后加入TRPV1（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000），4 ℃孵育过夜。次日洗膜，加入Ⅱ抗（1∶2 000）室温孵育2 h。使用ECL 化学发光法显影，ImageJ 统计学处理图像分析方法进行分析，以目的蛋白与内参蛋白β-actin 的灰度比值表示相应蛋白表达水平的高低。

1.7 统计学处理

采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，数据结果均以xˉ±s 表示，采用单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较，以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织W/D 值的比较

与对照组相比，模型组大鼠肺组织的W/D 显著升高（P<0.01），说明肺部水肿较严重；与模型组相比，黄芩茎叶-虎杖配伍组中的低、中、高剂量明显降低了大鼠肺组织W/D 值（P<0.05），提示药物可预防肺水肿。其中黄芩茎叶-虎杖配伍组中的中剂量效果较显著（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肺组织W/D 比较（n＝8，±s）Tab 2 Comparison of W/D of lung tissue of rats in each group（n＝8，±s）

表2 各组大鼠肺组织W/D 比较（n＝8，±s）Tab 2 Comparison of W/D of lung tissue of rats in each group（n＝8，±s）

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

W/D 2.06±0.21 6.92±0.35**5.74±0.70**#4.99±0.53**#3.84±0.20*##4.51±0.76**##31.62<0.0001组别对照组模型组阳性组低剂量黄芩茎叶-虎杖组中剂量黄芩茎叶-虎杖组高剂量黄芩茎叶-虎杖组剂量（g/kg）--5.0 3.5 7.0 14.0 FP--

2.2 各组大鼠肺组织病理变化的比较

结果显示，对照组大鼠肺泡结构完整，无炎性细胞浸润，未见病理变化；与对照组相比，模型组大鼠肺泡结构被破坏，可见片状血灶，有大量炎性细胞浸润；与模型组相比，黄芩茎叶-虎杖的中、高剂量组肺泡结构破坏明显改善，炎性浸润有所减轻。见图1。

图1 各组大鼠肺组织HE 染色（100×）Fig 1 HE staining of lung tissue of rats in each group（100×）

2.3 各组大鼠BALF 中炎性因子的比较

与对照组相比，模型组大鼠肺组织TNF-α、1L-1β 炎性细胞因子水平显著升高（P<0.01），提示炎性浸润偏多；与模型组相比，给药组大鼠BALF 中的TNF-α、1L-1β 水平明显降低（P<0.05），其中、高剂量尤为明显，差异均有统计学意义（P<0.05）。阳性药地塞米松组大鼠BALF 中的TNF-α、1L-1β 水平明显降低（P<0.05～0.01），见表3。

表3 各组大鼠BALF 中TNF⁃α、1L⁃1β 浓度的比较（pg/mL，n＝8，xˉ±s）Tab 3 Comparison of the concentrations of TNF⁃α and 1L⁃1β in the BALF of rats in each group（pg/mL，n＝8，xˉ±s）

2.4 各组大鼠血清中SOD 活性的比较

与对照组比较，模型组大鼠肺组织氧化应激水平SOD 活力降低（P<0.01）；与模型组相比，阳性组和低、中、高剂量黄芩茎叶-虎杖配伍组大鼠肺组织血清中SOD 水平明显增加（P<0.05）。见表4。

表4 各组大鼠血清中SOD 活性的影响（U/mL，n＝8，xˉ±s）Tab 4 Effects of SOD activity in serum of rats in each group（U/mL，n＝8，xˉ±s）

2.5 各组大鼠肺组织TRPV1 mRNA 表达的比较

与对照组相比，模型组大鼠肺组织TRPV1 mRNA 相对表达显著上调（P<0.01）；与模型组相比，阳性药地塞米松组和黄芩茎叶-虎杖的各剂量组大鼠肺组织TRPV1 mRNA 相对表达显著下调，差异均有统计学意义（P<0.05），且高剂量黄芩茎叶-虎杖组TRPV1mRNA 相对表达水平低于黄芩茎叶-虎杖低剂量组（P<0.05）。见表5。

表5 各组大鼠肺组织TRPV1 mRNA 表达的比较（n＝8，xˉ±s）Tab 5 Comparison of TRPV1 mRNA expression in lung tis⁃sues of rats in each group（n＝8，xˉ±s）

2.6 各组大鼠肺组织中TRPV1 蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组大鼠肺组织TRPV1 蛋白表达水平显著上调（P<0.01）；经黄芩茎叶-虎杖处理后，其与模型组相比，明显下调了TRPV1 的蛋白表达（P<0.01）。见图2、表6。

表6 各组大鼠肺组织中TRPV1 蛋白表达水平的比较（n＝8，xˉ±s）Tab 6 Comparison of TRPV1 protein expression in lung tis⁃sues of rats in each group（n＝8，xˉ±s）

图2 各组大鼠肺组织中TRPV1 蛋白表达情况Fig 2 The expression bands of TRPV1 protein in the lung tissues of rats in each group

3 讨论

ALI 是一种常见的临床疾病，会导致肺泡毛细血管膜损伤，广泛的中性粒细胞浸润和炎症介质的释放［9］。炎症反应在ALI 的发生和维持中起着重要作用［10，11］。因此，关注炎症过程的潜在目标将为预防和治疗ALI 提供新的治疗策略。

黄芩茎叶含有黄酮类、酚酸类等多种化学成分［12］，具有抗炎、抗病毒、抗氧化及保护心肌缺血等显著药理活性［8］。在黄芩药材采收过程中，黄芩茎、叶和花等黄芩地上部分被废弃，故本研究旨在对黄芩茎叶进行充分利用，加大对黄芩药用资源的开发利用［13］。虎杖主要有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒的作用［3］。现代研究发现虎杖中的主要成分白藜芦醇苷能降低血清TNF-α、IL-6 水平，增加SOD 水平，改善百草枯所致的急性肺损伤［14］。两药协同配伍发挥清热解毒功效，但具体作用及机制尚未阐明。本研究探讨了黄芩茎叶配伍虎杖对ALI 是否具有协同保护作用及具体作用机制。

在各种致病因素引起的肺损伤中，瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）已经被证明在炎症反应中充当重要角色［15，16］。大多数TRPV1 表达在肺内气道的上皮及上皮下、血管周围、气道平滑肌、肺泡等部位［17］。它可以被温度（>43 ℃）、辣椒素等激活，因此TRPV1 也被称为“热敏感性通道”。有文献报道，TRPV1 通道被激活后，能够显著降低气道炎症小鼠的炎症损伤，其过程可能与降低体内TNF-α、IL-6 等促炎细胞因子有关［18］。TNF-α、IL-6和IL-1β 是参与炎症反应的关键炎性介质，在ALI的发生发展过程中发挥着重要作用［19-22］。TNF-α和IL-1β 会增加肺上皮细胞的通透性，进而诱导肺组织损伤和中性粒细胞积聚，从而导致肺水肿［23］。

本研究结果显示，与模型组比较，大鼠肺组织肺泡结构被严重破坏，可见片状血灶，W/D 显著升高，肺水肿及大量炎性细胞浸润；而黄芩茎叶-虎杖组能明显改善破坏的肺泡结构，升高SOD 活力，降低大鼠肺组织，减少肺水肿和炎性浸润。

本研究，与模型组相比，黄芩茎叶-虎杖有效降低 了BALF 中TNF-α、1L-1β 的 水 平，表 明 药 物 对ALI 的改善与其对炎症反应的抑制有关。此外，Western blot 法与qRT-PCR 法结果显示，相比于模型组，黄芩茎叶-虎杖组显著下调TRPV1 蛋白和mRNA 相对表达水平，提示药物可能通过抑制TRPV1 对脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠产生明显的保护作用。

综上所述，黄芩茎叶-虎杖对LPS 诱导的ALI大鼠具有保护作用，并其作用机制可能与促进SOD的 活 力，抑 制TNF-α 和IL-1β 的 水 平 以 及 下 调TRPV1 表达发挥抗炎作用。

作者贡献度说明：

屈新亮：实验撰写和动物模型构建；段广靖：测定肺组织W/D 值；赵博：ELISA 实验；谢锋：动物饲养及分组；王斌：观察肺组织病理变化；高峰：qRT-PCR 实验；卫培峰：West‐ern blot 实验；李敏：实验设计及校稿。

所有作者声明不存在利益冲突。