基于网络药理学和分子对接分析醒消丸治疗肺癌潜在靶点及作用机制

周相男，胡凯文，李志明，高 磊，周 天

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院肿瘤科，北京 100078）

肺癌是全球最常见的癌症和死亡率最高的恶性肿瘤，2018 年GLOBOCAN 估算，肺癌新增209万病例，占癌症病例总数的11.6%，死亡病例新增176 万，占比18.4%。中国肺癌发病比例和死亡比例分别占全球病例的36.98%和39.21%，发病率和死亡率呈逐年上升趋势，总体5 年生存率约为19.7%，中位生存时间不超过2 年，严重危害人类健康［1，2］。肺癌传统治疗模式主要有手术、放疗或化疗等，但由于确诊时70%处于晚期［3］，加之放化疗不良反应等不足，使很多病人失去治疗机会，因此，亟需为年老体弱、中晚期及常规疗法失败的患者提供新的治疗策略。

恶性肿瘤是一种以局部病变为特征的全身疾病，肿瘤“体为阴，用为阳”，具有生命属性，易耗血夺气，使机体全身与局部不平衡，出现整体多虚多寒、局部多实多热的表现［4］。醒消丸出自清代王维德《外科证治全生集》，全方由雄黄、麝香、乳香、没药组成，功擅消肿散结、活血止痛，具有促进机体代谢、调和机体气血阴阳功效，与绿色治疗模式中第三阶段“帝道”的调整体质理念相契合［5］。临床研究表明，雄黄败毒抗癌，配伍干漆有效治疗肺部之癌瘤积聚［6］，六神丸（含麝香与雄黄）有效改善恶性肿瘤患者临床症状［7］，西黄丸（含麝香、乳香、没药）可显著提高临床获益率，稳定病情，提高生活质量［8］。

临床中发现，醒消丸凭借雄黄温热之性，有助于改善肺癌患者怕冷、便秘等症状，提高患者生活质量。然而，目前尚缺乏医学证据支持，因此本文拟通过网络药理学和分子对接，预测醒消丸治疗肺癌的靶点及通路，填补其分子机制层面的研究，从而为后续基础实验研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 醒消丸有效成分收集及潜在靶点筛选

雄黄属于矿石药，查阅中医数据库平台，尚无雄黄的有效成分及靶点，查阅文献其有效成分为As2S2和As4S4［9，10］，根 据SwissADME 和SwissTar‐getPrediction 预测无法得到有效靶点，靶点预测工具或平台尚待开发，因此，本文拟进行麝香、乳香和没药的相关研究，初步对醒消丸治疗肺癌的靶点进行 预 测 和 分 析。BATMAN‐TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman‐tcm）［11］是中药分子机制的在线分析平台，本文通过BATMAN‐TCM 平台获得醒消丸 化 合 物 成 分。 PubChem 数 据 库（https：//pub‐chem.ncbi.nlm.nih.gov/）是NCBI 旗下有机小分子生物活性数据库，包括结构、活性、来源及实验等多种数据［12］，通过PubChem 分别查找麝香、乳香、没药各成分的化学结构式，并经SwissADME（www.SwissADME.ch）［13］筛选获取有效成分，运用SwissTar‐getPrediction（www.SwissTargetPrediction.ch）［14］预测各有效成分的靶点，整合为EXCEL 文件。筛选结束后，以“reviewed”“homo sapiens”为条件，运用Uni‐prot 蛋 白 质 数 据 库（https：//www.uniprot.org）［15，16］对潜在靶点进行筛选，并统一将蛋白质靶点信息标准化，命名为gene symbol。

1.2 肺癌相关靶点筛选

以“lung cancer”为关键词，寻找OMIM 数据库（OMIM‐Gene‐Map‐Retrieval）（https：//www.omim.org）［17］、TTD 数 据 库（http：//bidd. nus. edu. sg/group/cjttd）［18］、DRUGBANK 数 据 库（https：//www. drugbank.ca）［19］中 肺 癌 的 潜 在 靶 点，并 挖 掘GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org）相关靶点，合并4 个疾病数据库靶点后，删除重复值得到肺癌蛋白质靶点。

1.3 醒消丸‐肺癌交集靶点PPI 网络构建及核心靶点筛选

利用Venn 工具将麝香、乳香、没药3 药与肺癌靶点取交集并绘制韦恩图。进而将交集靶点提交至Sting 平台，构建交集靶点PPI 网络。运用Biso‐Genet3.0 插件，分别构建醒消丸与肺癌靶点PPI 网络的Merged 网络，根据连接度（Degree）、介度（Be‐tweenness Centrality，BC）、紧密度（Closeness Cen‐trality，CC）、平均连接度（Local Average Connectivi‐ty，LAC）［20］4 个属性值进行中位数筛选，得到核心靶点。

1.4 醒消丸‐肺癌靶点功能与通路的富集分析

Metascape 数据库（http：//metascape.org/）［21］是一个生物信息数据库，提供全面的基因列表注释及分析资源，主要用于差异基因的功能和通路富集分析。在线登录Metascape 平台，导入交集靶点，对其主要的生物学过程与代谢通路进行富集分析，并用Hiplot 在线网站绘制靶点生物过程（GO Biological Processes，GO BP）、靶点所在细胞组分（GO Cellu‐lar Components，GO CC）、靶点分子功能（GO Mo‐lecular Functions，GO MF）及靶点信号通路（KEGG Pathway）图［22］。

1.5 醒消丸有效成分‐靶点‐通路网络图构建

Cytoscape3.7.2 是一款图形化显示网络并进行分析和编辑的软件，通过将麝香、乳香、没药的活性成分及其治疗肺癌靶点、信号通路等数据整合，导入软件，构建网络图，进行可视化分析。

1.6 分子对接验证

PDB 蛋 白 数 据 库（https：//www.rcsb.org/）［23］是一种蛋白质晶体结构数据库，提供蛋白靶点的晶体复合物结构信息。PyMOL 软件是一款分子可视化软件，用于查看蛋白三维结构，分离蛋白和小分子。 Open Babel GUI 软件用来转换格式。AutoDock4.2.6 用于预测配体和生物大分子靶标之间相互作用，包含AutoGrid 和AutoDock 两个程序，AutoDock Tools1.5.6 是将分子在结构图形化、可视化对接的辅助软件。通过Autodock Tools 将麝香、乳香、没药的核心成分和靶点进行对接并验证。

2 结果

2.1 获取麝香、乳香、没药活性成分及潜在靶点

在BATMAN‐TCM 平台“ Cluster name”中，分别 输 入“ SHE XIANG”、“RU XIANG”和“MO YAO”，并将“ Score cutoff”值设置为20，P值调整为0.05 以获得麝香、乳香、没药的化合物成分，其中，麝香、乳香和没药的成分分别有30、19、15 种，统一以“SX1～SX30，RX1～RX19，MY1～MY15”简称，如表1 所示，其中，部分化合物尚无统一标准名称及属性值，故未标注。通过PubChem 获得麝香、乳香、没药化合物的化学结构式，导入SwissADME 平台筛选，符合“胃肠吸收度”为“high”，以及“类药性”的五个过滤器属性值中有两项或以上为“yes”的通过筛选，结果获取麝香有效化学成分20 种、乳香有效化学成分8 种、没药有效化学成分13 种，见表1。通过SwissTargetPrediction 预测各有效成分的靶点，设置“probability>0”的为有效靶点，并整合为EXCEL文件。其中，麝香有效成分作用靶点769 个、乳香273 个、没药469 个，合并成分靶点，删除重复值，并经UniProt 筛选后得到121 个靶点。

表1 醒消丸有效成分及SwissADME 属性值Tab 1 Active ingredients and SwissADME attribute values of Xingxiao Pill

2.2 筛选肺癌相关靶点

从GeneCards 筛选疾病相关靶点，并设定Score大于中位数的目标靶点为疾病潜在靶点，根据肺癌相关靶点，取中位数为16.855，得到1 449 个靶点，并结合OMIM（OMIM‐Gene‐Map‐Retrieval）、DRUG‐BANK、TTD 数据库，合并所有肺癌靶点后删除重复值得到1 914 个相关靶点。

2.3 构建醒消丸‐肺癌交集靶点PPI 网络并筛选核心靶点

运用Venn 为肺癌相关靶点与醒消丸的活性成分靶点取交集，得到交集靶点50 个，见图1。String平台构建交集靶点PPI 网络，见图2，图中节点大小和颜色、连线粗细和颜色反映了靶点之间相互关联，节点越大，颜色越亮，节点之间连线越粗、颜色越暗，代表此靶点连接越关键。交集靶点及所属成分见表2。应用BisoGne3.0 分别得到醒消丸成分靶点与肺癌靶点的PPI 网络，二者融合得到Merged 网络，根据Degree 筛选2 倍中位数后，提取Hithubs 核心网络，并根据Degree、BC、CC、LAC 等参数进行中位数筛选，得到核心网络，见图3，获取核心靶点18 个，选取与肺癌机制相关且有较多文献支持的8个靶点用来后续预测与研究，具体见表3。

表2 交集靶点对应醒消丸成分Tab 2 The intersection targets corresponding to the composition of Xingxiao Pill

表3 醒消丸治疗肺癌的核心靶点Tab 3 Core targets of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

图1 醒消丸治疗肺癌交集靶点韦恩图Fig 1 Venn diagram of intersection targets of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

图2 醒消丸治疗肺癌交集靶点PPI 网络图Fig 2 PPI network diagram of intersection targets of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

图3 醒消丸治疗肺癌核心靶点的筛选流程图Fig 3 Screening flowchart of core targets of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

2.4 靶点生物学功能与通路的富集分析

将麝香、乳香、没药与肺癌交集靶点提交至Metascape 平台，进行富集、聚类分析，并对结果进行可视化。靶点信号通路结果显示醒消丸治疗肺癌的核心靶点在细胞中主要涉及EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、PI3K‐Akt、蛋白聚糖、MAPK、细胞周期、Th17 细胞分化、转录失调、MicroRNA、MTOR、非小细胞肺癌、中心碳代谢等信号通路，见表4 和图4。GO 功能注释显示其主要参与的生物过程为RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录、上皮细胞发育、细胞对氮化合物的反应、细胞分化的负调控、神经过程正向调节、细胞成熟、细胞黏附调节、神经胶质细胞分化、自噬调节、细胞分解代谢正向调控、激素水平调节等；主要细胞组分即靶点所在的细胞位置为微管组织中心、中心体、染色体区域、树突、细胞膜区域、细胞质囊腔、纺锤轴等；主要靶点分子功能为调控蛋白激酶、磷酸转移酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶、跨膜受体蛋白激酶、细胞周期依赖性蛋白、组蛋白激酶、氧化还原酶等的活性，转录因子、RNA 聚合酶II 转录因子、生长因子、激素等，见图5。

图4 醒消丸治疗肺癌靶点信号通路富集分析Fig 4 Enrichment analysis of the signal pathways of the targets of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

图5 醒消丸治疗肺癌靶点生物过程、细胞组分、分子功能富集分析Fig 5 Enrichment analysis of biological process，cell com⁃ponent and molecular function of the targets of Xingxiao Pill in treatment of lung cancer

表4 醒消丸与肺癌交集靶点的信号通路Tab 4 signaling pathways of targets of Xingxiao pill in treatment of lung cancer

2.5 醒消丸有效成分‐靶点‐通路网络图的构建

运用Cytoscape3.7.2 构建醒消丸有效成分‐靶点‐通路网络，运用Network Analysis 分析，依据De‐gree、BC、CC 筛选醒消丸调治肺癌的核心成分，预测核心成分为桑色素、没药萜醇、蜕皮激素、睾酮、乙酸辛酯、二苯基环丙烯酮、甲基丁香酚、α‐雌二醇、雌二醇、丁香酚、麝香酮等，见表5。有效成分‐靶点—通路网络中，蓝色方形代表靶点，紫色菱形代表通路，粉色、黄色、绿色六边形分别代表麝香、乳香、没药核心成分，黄色方形代表乳香没药共有成分，药物成分、通路与靶点之间的相互网络见图6。

表5 醒消丸治疗肺癌的核心成分Tab 5 Core components of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

图6 醒消丸有效成分‐靶点‐通路网络图Fig 6 Active ingredients，targets and pathways network diagram of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

2.6 醒消丸核心成分与靶点的分子对接结果

运用Open Babel GUI 软件将麝香、乳香、没药的核心成分的化合物结构转换为pdb 文件。应用PyMOL 软件对核心蛋白结构修饰，选取可以查到结构的核心成分与交集靶点及核心靶点（表6），运用Autodock 进行对接分析。分子对接结合能（Binding energy，BE）结果如表6 所示，以BE≤−5.5（kJ·mol‐1）为稳定结合构象，表6 中加粗部分为稳定结合构象，图7 为部分构象结合图。运用R 语言绘制热图（heatmap）以直观反映药物与靶点对接情况，见图8，热图的颜色明暗反映了结合能的大小，颜色越暗，结合能越小，结合构象越稳定。因而得出睾酮分别与SIRT7、AKT1、VEGFA 和MDM2，以及雌二醇分别与AR、AKT1、SIRT7、MDM2 和XPO1 的结合构象较稳定。

图8 醒消丸核心成分与靶点对接的热图Fig 8 Heatmap of core components of Xingxiao Pill dock⁃ing with targets

表6 醒消丸核心成分与靶点对接结合能表Tab 6 Docking and binding energy table between main components of Xingxiao Pill and the targets

图7 醒消丸核心成分与靶点对接的结构图Fig 7 Docking structure diagram between main components of Xingxiao Pill and targets

3 讨论

醒消丸原是治疗外科痈疽肿毒效验方，现临床发现其在肺癌治疗中起到一定疗效，具有打击局部邪气，维护全身正气作用，遂扩大其应用范围至肺癌，以求老药新用，通过网络药理学整合大量数据库资源［24］，研究其治疗靶点及通路，具有传承创新；在肺癌临床应用中，醒消丸君药雄黄豁痰解毒，臣药麝香活血通络，佐以乳香、没药活血化瘀止痛，全方共奏活血化瘀、以通为补，进而促进机体代谢，调和阴阳、平衡寒热，符合“帝道”阶段以调整体质、调和气血阴阳为主的“绿色治疗”理念，具有理论创新，值得进一步研究。

本研究初步筛选出醒消丸治疗肺癌多种活性成分。其中，桑色素［25］和乙酸辛酯［26］具有调控癌细胞周期作用，雌二醇［27］、麝香酮［28，29］和丁香酚［30］与诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成相关，睾酮激素水平升高与肺癌风险增加呈正相关［31，32］。研究表明，醒消丸中雄黄具有诱导肺癌细胞凋亡及抑制肿瘤生长效应［33］，麝香通过调控IL‐24、TNF 家族基因、MAPK 通路等发挥抗癌效应［34］，乳香与肺癌细胞凋亡、自噬、调控细胞周期相关［35］，没药或乳香没药配伍具有多种抗肿瘤活性，如抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化和凋亡、产生细胞毒性、抑制肿瘤血管生成等［35，36］，进一步佐证了本文上述核心成分的抗瘤机制和功效。

本研究通过构建交集靶点PPI 网络发现，麝香有10 种成分映射于AR，有1 种与IL‐6 有关。乳香活性成分靶向HSP90AA1、STAT3 和AR，没药与VEGFA、IL‐6、MTOR 和AR 相关。AR 是一种雄激素受体，与癌症风险显著相关。HSP90AA1 与肺癌细胞增殖或凋亡、信号传导相关［37］。STAT3［38，39］和VEGFA 在肿瘤血管生成、肿瘤转移中扮演重要角色［40］。 IL‐6 调 控 肿 瘤 免 疫 和 炎 症 微 环 境［41］。MTOR 可调节肿瘤细胞的生长、代谢、衰老和自噬等过程，已被作为治疗靶标用于免疫疗法中［42］。通过BisoGenet3.0 插件筛选核心靶点，映射于醒消丸各成分发现AKT1 为核心要素，具有调控癌细胞存活、细胞周期、核糖体生物发生、蛋白质合成等作用，目前已成为癌症治疗靶标［43］。

KEGG 结果显示，PI3K/Akt/mTOR［44，45］、蛋白聚 糖［46］、MAPK［47］、MicroRNA 和 中 心 碳 代 谢［48］在癌细胞生长、代谢重编程中占有重要地位。蛋白聚糖、MAPK 信 号 通 路［49］具 有 调 控 肿 瘤 血 管 生 成 功能。EGFR［50］、PI3K/Akt［51］在克服多药耐药方面具有重要贡献。MicroRNA［52］、细胞周期、Th17 细胞途径在肿瘤细胞周期、凋亡、炎症、衰老中发挥重要作用。

综上，本文根据网络药理学初步挖掘了醒消丸治疗肺癌的抗癌靶点和通路，综合分子对接和文献研究结果，初步预测醒消丸抗癌机制涉及调控肺癌细胞凋亡、周期、血管生成、代谢重编程等途径，MTOR、AKT1、VEGFA、SIRT7 及PI3K/AKT/mTOR、MAPK 为可能的靶点和通路。基于此，后续将进一步进行实验研究，探究醒消丸调治肺癌的机制。

作者贡献度说明：

周相男：统计数据、制作图表并撰写；胡凯文：中医理论指导；周天：全文审核与指导；李志明：指导并修改前言与讨论部分；高磊：方法指导。