基于Nrf2⁃NQO1/γ⁃GCS 信号通路探讨续断种子方对少弱精子症模型大鼠附睾氧化损伤的保护机制

林自立，王 瑀，陈 露，陈 六，张亚光，王权胜

（1.广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院男性科，广西 南宁 530023）

少弱精子症为引起男性不育的重要因素之一。前期临床研究治疗少弱精子症患者，选用续断种子方，具有良好的疗效［1］。相关研究认为，少弱精子症发病机制与氧化应激密切相关［2］。核因子红细胞相关因子2（nuclear factor erythroid like 2，Nrf2）启动下游抗氧化酶的醌氧化还原酶‐1（NQO1）、γ‐谷氨酰 半 胱 氨 酸 合 成 酶（γ‐glutamylcysteinesynthetase，γ‐GCS），从而发挥抗氧化作用，稳定精子内环境［3，4］。前期基础实验研究证明了续断种子方可以通过调控机体抗氧化酶活性，提高生精细胞拮抗氧化应激能力，提高精子质量［5］。续断种子方能否通过Nrf2‐NQO1/γ‐GCS 信号通路减轻少弱精子症大鼠氧化应激损伤，从而提高精子质量，目前尚未见研究报道。立足上述研究基础，本实验建立少弱精子症模型大鼠，研究续断种子方在治疗少弱精子症模型大鼠过程中对Nrf2、NQO1、γ‐GCS 相关蛋白的影响，旨在进一步探究续断种子方改善模型大鼠附睾氧化损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD 大鼠40 只［购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2019‐0014］，年龄为6～8 周，体质量200～220 g。笼饲养于动物房，自由饮食、自由饮水、每隔3 d 更换每笼木屑垫料。饲养环境：室内温度维持19～25 ℃，湿度维持55%～65%。本实验通过广西中医药大学动物伦理委员会批准。

1.2 实验仪器

石蜡包埋机（德国Leica 公司）；台式冷冻离心机（Eppendorf 公司）；半自动轮转切片机（英国Ther‐mo Shandon 公司）；病理组织烤片机（常州市郝思琳医用仪器有限公司）；光学生物显微镜（ympus 公司）；精子计数板与彩色精子质量检测系统（北京伟力有限公司）。

1.3 实验试剂

动物组织总RNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（南京诺唯赞生物科技有限公司）；Nrf2 抗体购自Affinity 公司（批号：AF0639）、NQO1 抗 体 购 自Affinity 公 司（批 号：DF6437）；γ‐GCS 抗体购自Affinity 公司（批号：DF8550）。

1.4 实验药物

续断种子方颗粒由江阴天江药业有限公司制备，药物组成：菟丝子、杜仲、续断、牛膝、骨碎补、女贞子、枸杞子、党参、白术、淮山药各15 mg 组成，采用中药配方颗粒剂（药品许可证号：1203002）；左卡尼汀口服溶液10 mL：1 g（东北制药总厂生产，国药准字H19990372）；环磷酰胺粉针剂（Baxter 公司，进口药品注册证号：H20160467）。

1.5 实验方法

1.5.1 动物分组与造模 大鼠适应性饲养1 周后，按随机原则分为空白组、模型组、续断种子方组、左卡尼汀组，每组各10 只，除空白组外，余下3 组诱导为少弱精子症模型，方法为：将环磷酰胺以生理盐水配置成3.5 g/L 溶液，予腹腔注射，注射剂量为0.035 mg·g‐1·d‐1，持续注射7 d。

1.5.2 给药方法 造模验证成功后开始药物干预治疗，续断种子方组给予10 g/kg 续断种子方溶液灌胃，左卡尼汀组给予左卡尼汀口服溶液0.1 g/kg灌胃。1 次/日，时间连续8 周。

1.5.3 标本制作及检测附睾精子质量 断颈处死大鼠，迅速开腹摘取双侧附睾组织，放置于添加10 mL 生理盐水中将其剪碎，37 ℃恒温水孵育5 min，摇晃，使精子游离出来，运用精子计数板中，运用自动精子分析仪（Computerassisted sperm analysis，CASA）进行检测精子浓度、精子活率。

1.5.4 苏木素‐伊红染色法染色（Hematoxylin Eo‐sin，HE）观察附睾显微结构 4%多聚甲醛固定附睾组织；乙醇脱水；二甲苯进行透明；包埋，切片，HE 染色法染色，光镜下观察附睾组织改变。

1.5.5 RT‐QPCR 检 测 附 睾 组 织 中Nrf2、NQO1、γ‐GCS mRNA 表达 取匀浆后的附睾组织，使用Trizol 法提取总RNA，检测RNA 浓度和纯度，调整RNA 浓度至1 μg，并按说明书逆转录cDNA。在体系 中 加 入 引 物（表1）和SYBR‐Green 试 剂，于Roche‐LightCycler‐480 型 实 时 荧 光 定 量PCR 仪 上，以三步法对cDNA 进行扩增，通过ΔΔCT=（目的基因CT−目的内参基因CT）−（空白基因CT−空白内参基因CT），计算各组2‐ΔΔCT，即得各组信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表达与对照组mRNA 的倍数。引物序列见表1。

表1 RT⁃qPCR 的特异性引物序列Tab 1 RT⁃qPCR specific primer sequence

1.5.6 免疫组织化学法检测附睾组织中Nrf2、NQO1、γ‐GCS 蛋白表达 取附睾组织进行常规制备石蜡切片，以免疫组化法检测各组大鼠Nrf2、NQO1、γ‐GCS 蛋 白 表 达。光 镜 下 观 察 各 组Nrf2、NQO1、γ‐GCS 蛋白表达情况。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 分组造模结果

造模后各组大鼠均出现活动减弱、不同程度的饮水和进食减少，体重下降，毛发干枯，自主活动频率减少，反应迟缓等症状，药物干预后1 周后上述情况逐渐好转。在造模中左卡尼汀组、模型组、续断种子方组均出现死亡，死亡因素考虑为：因剂量及体重计算不够精确出现死亡2 只（模型组1 只、左卡尼汀片组1 只），灌胃过程中因食管血管破裂、刺破胃等原因致只大鼠死亡1 只（续断种子方组1 只）。所以最终大鼠数量为37 只。

2.2 各组大鼠精液质量比较

精子密度和精子活动率：相较于空白组，其余组精子密度、活动率均明显降低（P<0.05），模型组精子密度、活动率明显降低（P<0.05）；与模型组比较，续断种子方组和左卡尼汀组精子密度和活动率均明显升高（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠精液质量比较（±s）Tab 2 Semen quality comparison of rats in each group（xˉ± s）

表2 各组大鼠精液质量比较（±s）Tab 2 Semen quality comparison of rats in each group（xˉ± s）

组别空白组模型组续断种子方组左卡尼汀组n 10 9 9 9 FP精子浓度（×106/mL）51.47±3.13 11.49±1.39 34.42±3.45 33.00±3.45 269.331 0.000活动率（%）63.15±2.12 20.65±1.86 41.13±2.33 35.32±1.60 743.531 0.000

2.3 大鼠附睾组织病理形态改变

视野内可见空白组附睾管排列紧密规则，组织结构完整，上皮细胞排列规整，管腔精子数目多，分布均匀。模型组附睾组管腔织出现结构萎缩，排列疏松，间质变大，细胞碎片增多，精子细胞明显减少。续断种子方组、左卡尼汀组与模型组相比，附睾管腔病变具有显著改善，腔内正常精子量增多，分布均匀，见图1。

图1 各组附睾病理结果Fig 1 Pathological results of epididymis in each group

2.4 各 组 大 鼠 附 睾 组 织 中Nrf2、NQO1、γ‐GCS mRNA 表达比较

实时荧光定量聚合酶链反应（real‐time fluores‐cent quantitative polymerase chain reaction，RT‐qPCR）结果显示，相较于空白组，模型组大鼠附睾Nrf2、NQO1、γ‐GCS mRNA 表达明显降低（P<0.05），与模型相比，续断种子方组、左卡尼汀组Nrf2、NQO1、γ‐GCS mRNA 表 达 明 显 升 高（P<0.05），见表3。

表3 各组大鼠附睾Nrf2、NQO1、γ⁃GCSmRNA 相对表达量的比较（±s）Tab 3 Comparison of relative expression of NRF2，NQO1，γ⁃GCS mRNA in epididymis of rats in each group（±s）

表3 各组大鼠附睾Nrf2、NQO1、γ⁃GCSmRNA 相对表达量的比较（±s）Tab 3 Comparison of relative expression of NRF2，NQO1，γ⁃GCS mRNA in epididymis of rats in each group（±s）

组别空白组模型组续断种子方组左卡尼汀组n 10 9 9 9 FP基因相对表达量Nrf2 1.00 0.66±0.05 0.85±0.03 0.90±0.03 56.849 0.000 NQO1 1.00 0.72±0.06 0.83±0.05 0.86±0.05 13.981 0.002 γ‐GCS 1.00 0.67±0.05 0.82±0.04 0.87±0.07 46.312 0.000

2.5 各组大鼠附睾组织Nrf2、NQO1、γ‐GCS 蛋白表达比较

各组大鼠附睾组织Nrf2、NQO1、γ‐GCS 免疫组化法显示，模型组Nrf2、NQO1、γ‐GCS 免疫组化棕黄色阳性表达低（图2B、3B、4B）；续断种子方组、左卡尼汀组Nrf2、NQO1、γ‐GCS 免疫组化中棕黄色阳性表达明显较高（图2C、2D；图3C、3D；图4C、4D），空白组Nrf2、NQO1、γ‐GCS 免疫组化中棕黄色阳性表达最高（图2A、3A、4A）。

图2 各组大鼠附睾组织Nrf2 蛋白表达（IHC × 200）Fig 2 Expression of Nrf2 protein in epididymis of rats in each group（IHC × 200）

3 讨论

少弱精子症目前引起男性不育的中重要因素之一，少弱精症的发生有多种原因，例如：氧化应激、生殖道感染、精索静脉畸形扩张与弯曲等，各因素相互影响，致使少弱精子症的发生［6］。目前研究认为，少弱精子症发病机制与氧化应激损伤紧密相关［2］。原因为精子质膜上双键的不饱和脂肪酸受到活性氧（ROS）侵犯，精子质膜过氧化损伤，导致精子的活动能力下降。同时还破坏线粒体的内外膜，激活相关凋亡蛋白而导致精子死亡［7，8］。

少弱精子症将其归属为中医“精冷”“精少”“精浊”等相关范畴。近些年来，诸多学者根据中医“肾藏精”、为“先天之本”的理论，认为肾虚为本病主要的病因病机，与肝郁与脾虚相关；基于课题组对文献研究与临床实践，以为本病主要病因病机为“营气不从，肾精亏虚，营气不从”，营气不从可理解为附睾部分气血缺乏，肾主生殖，主藏精，肾脾在精血生成方面相互为用，脾主运化，摄取谷食中精微物质并化营生血，先后天互为滋养，脾脏健运，肾精充盈，脾肾共同所化精血提供营养物质，若脾失运化，则营气不从，气血不足，导致营卫失和，附睾组织血管供养血液及营养物质作用失调，导致营养失充，精子无法成熟；若肾精亏虚，则气血郁滞，经络阻塞，精络不畅，输送营养道路受阻，精子活力降低，最终导致精子行走通道不通则不育。则治当以补肾健脾为法，佐以活血生精的续断种子方，此方源自岳甫嘉《医学正印·卷上》：“固肾健脾生精种子奇方”，岳甫嘉认为脾的运化功能为男性出生后营养物质主要来源，若气血充盈，则肾精满溢，生精种子源源不绝，此方为生精最快，加之节制欲望，得子更易。方中菟丝子、枸杞子、女贞子、山药、白术、党参以补气健脾，益肾生精；杜仲、续断、骨碎补以补肾生精，活血通络；诸药合用具有健脾益肾、活血生精之功效。现代药理学证实该方中主要药物的菟丝子与枸杞子成分含有总黄酮［9，10］、女贞子中含有齐墩果酸［11］、续断成分含皂苷类［12］、杜仲多糖［13］具有抗氧化、清除自由基、提升氧气利用率等作用。

近些年来研究发现生殖系统过氧化，即氧化应激成为男性不孕不育的共同特征［14］。氧化应激是因为体内氧自由基的产生和抗氧化能力的失衡而导致的［15］，其中ROS 为活性氧簇，其具有较高的活性，是衡量机体是否具有抗氧化能力的一个重要指标之一［16］。Nrf2 通过激活抗氧化酶的转录从而维持氧化还原过程动态平衡，为细胞内调控氧化还原过程的重要转录因子［17］，具有抗凋亡［18］、维持细胞氧化还原稳态［19］、抗炎症反应［20］等功能。正常条件下，Nrf2 在细胞质中通过与Kelch 样环氧氯丙烷相关 蛋 白1（Kelch‐like ECH‐associated protein1，Ke‐ap1）在细胞质结合而失去活性，处于一种未激活稳态，如果受外界氧化应激情况下，Nrf2 不再处于稳态，从而脱离至细胞核中，并与抗氧化元件（antioxi‐dant response elements，AREs）结 合，继 而 调 控NQO1、γ‐GCS 等下游蛋白的表达，提升细胞抗氧化能力与降低氧化应激损伤［21，22］。有相关研究发现通过激活Nrf2/ARE 信号通路，调控Nrf2 的下游靶基因NQO1 及γ‐GCS 等相关蛋白的表达，提高Nrf2、NQO1 及γ‐GCS 的蛋白的表达水平，提升机体抵抗能力，调控抗氧化机制作用，减轻生精障碍，改善精子活力［23，24］。实验结果表明：相较与空白组，其余组精子密度和精子活动率均明显降低（P<0.05），模型组精子密度、活动率明显降低（P<0.05），提示造模成功；与模型组比较，续断种子方组和左卡尼汀组精子密度和活动率均明显升高（P<0.05），证明续断种子方可以提高精子质量。模型组NQO1、γ‐GCS相关水平明显降低，与治疗组与模型组比较，Nrf2、NQO1、γ‐GCS 相关水平明显升高，提示续断种子方可以减轻大鼠氧化应激损伤。

综上所述，续断种子方能够减轻大鼠氧化应激损伤，提高少弱精子症大鼠精子质量，其作用机制可能是促进少弱精子症大鼠附睾组织Nrf2‐NQO1/γ‐GCS 信 号 通 路 活 化，上 调Nrf2、NQO1 和γ‐GCS蛋白表达相关。

作者贡献度说明：

林自立：数据整理与分析，撰写论文；王瑀：建立模型；陈露：建立模型、药物干预；陈六：指标检测；张亚光：负责文章的校对、完善；王权胜：研究总负责人、指导教师。

作者之间没有任何利益冲突。