姜黄素对前列腺癌PC-3细胞体外生长的影响

2022-06-20 05:34程继高丹付国董青川
西部医学 2022年6期
关键词:依赖性姜黄空白对照

程继 高丹 付国 董青川

(陕西省人民医院泌尿外科, 陕西 西安 710068)

前列腺癌(Prostate cancer)是常见的恶性肿瘤,手术切除、放疗和化疗是目前常用的临床治疗手段[1-2]。但常规化疗药物和放射治疗引起的副作用,严重影响了患者术后的康复和生活质量[3-5]。研究前列腺癌的病理学进程,不断探寻其发病的分子机制,寻找新的治疗靶点和治疗手段,是目前临床急需解决的问题。姜黄素(Curcumin)是一种多酚类物质,提取于姜黄、郁金等姜科植物中[6]。国内外的研究均已证实[7-8],姜黄素具有抗氧化、抗炎等作用,同时还有抑制肿瘤生长的效应。但姜黄素对前列腺癌生物学行为的影响,以及参与上述调控进程的相关信号通路分子,目前依然不完善,需要进一步的体内外研究来证实。Notch1分子与前列腺癌的增殖密切相关,可以通过其下游的PI3K-AKT-mTOR和MEK-ERK途径,分别影响肿瘤血管生成和体外生长的过程[9]。但是否姜黄素通过影响Notch1分子,调控前列腺癌的发生和发展过程,目前相关报道鲜少,仍有待进一步的研究。 本实验以人前列腺癌PC-3细胞为研究对象,通过给予不同浓度的姜黄素处理,观察前列腺癌细胞增殖和凋亡的变化,同时分析姜黄素对Notch1分子表达水平的影响,观察是否姜黄素影响前列腺癌PC-3细胞体外生长,进一步阐明姜黄素抑制前列腺癌生长的分子机制,为临床前列腺癌的化疗提供新的策略和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料和细胞培养 人前列腺癌PC-3细胞株购于美国ATCC公司。姜黄素(Curcumin)购于 Sigma公司。DMEM培养液和胎牛血清均购于Invitrogen公司。人前列腺癌PC-3细胞,参考文献常规培养,37℃孵箱,95%O2和5%CO2,DMEM培养液包括10%灭活血清。

1.2 对细胞增殖的影响 常规培养人前列腺癌PC-3细胞,接种于96孔培养板,密度为5×103/孔,给予不同浓度的姜黄素处理(溶于DMSO),分别为500 nmol/L组、10 μmol/L组、100 μmol/L组和空白对照组(给予DMSO处理)。收集细胞,通过MTT法观察姜黄素对PC-3细胞增殖的影响。PCNA mRNA可反应肿瘤细胞增殖水平,收集上述细胞,提取RNA,通过定量PCR法检测PCNA mRNA水平的变化,观察不同浓度姜黄素对PC-3细胞中PCNA mRNA的影响,分析各组间差异。

1.3 细胞凋亡的变化 收集不同处理组的细胞,与Annexin V/PI溶液室温孵育30 min,通过流式细胞仪检测不同处理组PC-3细胞凋亡率的变化,观察不同浓度姜黄素处理3 d后,对PC-3细胞凋亡率的影响。Bcl-2分子mRNA水平可反应肿瘤细胞凋亡状态,收集上述细胞,提取RNA,通过定量PCR法,检测Bcl-2 mRNA水平的变化,观察不同浓度姜黄素对PC-3细胞中Bcl-2 mRNA水平的影响,分析各组间差异。

1.4 Caspase活性检测 收集不同处理组的细胞,按Caspase活性检测试剂盒操作规范要求,处理细胞,离心20 min,2000转/min,上清孵育60 min,测定各组样品吸光度的变化,分析PC-3细胞中Caspase-3和Caspase-9活性的变化,观察不同浓度姜黄素处理3 d后,对PC-3细胞中Caspase活性的影响。

1.5 分析Notch1和PI3K的变化 PC-3细胞经不同浓度姜黄素处理3 d后,收集上述经过姜黄素处理的细胞,提取RNA,通过定量PCR法,检测PC-3细胞中Notch1和PI3K mRNA水平变化,分析各组间差异;同时,PC-3细胞经不同浓度姜黄素处理3 d后,收集上述各组细胞,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,通过蛋白质电泳检测PC-3细胞中Notch1和PI3K蛋白表达的变化。

2 结果

2.1 姜黄素对PC-3细胞增殖的影响 500 nmol/L组、10 μmol/L组和100 μmol/L组其存活率均显著低于空白对照组(P<0.05);而与500 nmol/L组比较,10 μmol/L组和100 μmol/L组对PC-3细胞增殖的影响差异有统计学意义(P<0.05),提示姜黄素影响PC-3细胞增殖的效应具有一定的剂量依赖性。实验结果还发现,姜黄素抑制PC-3细胞增殖的效应具有一定时间依赖性,PC-3细胞经低剂量姜黄素处理3 d后,细胞增殖水平受到显著抑制。500 nmol/L组其PCNA mRNA水平降低,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。10 μmol/L组和100 μmol/L组中PCNA mRNA水平显著低于500 nmol/L组(P<0.05),提示姜黄素降低PCNA mRNA水平,抑制PC-3细胞增殖,并体现一定的剂量依赖性。见表1、图1。

表1 姜黄素对前列腺癌PC-3细胞存活率的影响Table 1 Effect of Curcumin on PC-3 cell proliferation

2.2 姜黄素对PC-3细胞凋亡率的影响 500 nmol/L组凋亡率高于空白对照组(P<0.05);与500 nmol/L组比较,10 μmol/L组、100 μmol/L组对PC-3细胞凋亡率的影响差异有统计学意义(P<0.05),提示姜黄素影响PC-3细胞凋亡率的效应具有一定的剂量依赖性。PC-3细胞中Bcl-2 mRNA水平较高,500 nmol/L组Bcl-2 mRNA水平降低,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。10 μmol/L组和100 μmol/L组细胞中Bcl-2 mRNA水平显著低于500 nmol/L组(P<0.05),提示姜黄素降低Bcl-2 mRNA水平,诱导PC-3细胞凋亡,并体现一定的剂量依赖性。见表2、图2。

表2 姜黄素对PC-3细胞凋亡率的影响Table 2 Effect of Curcumin on PC-3 cell apoptosis

2.3 姜黄素对PC-3细胞中Caspase活性的影响 500 nmol/L组Caspase-3和Caspase-9活性高于空白对照组(P<0.05)。同时,姜黄素对Caspase-3和Caspase-9活性的影响,也体现一定的剂量依赖性,10 μmol/L组和100 μmol/L组PC-3细胞中Caspase-3和Caspase-9活性显著高于500 nmol/L组(P<0.05)。见图3、图4。

2.4 姜黄素对PC-3细胞中Notch1水平的影响 PI3K-AkT-mTOR是Nototh1分子下游信号途径,Notch1通过上述途径调控肿瘤细胞的体外生长状态。500 nmol/L组Notch1和PI3K 蛋白表达降低,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。10 μmol/L组和100 μmol/L组PC-3细胞中Notch1和PI3K蛋白表达显著低于500 nmol/L组(P<0.05),提示姜黄素可抑制Notch1和PI3K蛋白表达,并体现一定的剂量依赖性。PC-3细胞中Notch1和PI3K mRNA水平较高,500 nmol/L组Notch1和PI3K mRNA水平降低,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。10 μmol/L组和100 μmol/L组PC-3细胞中Notch1和PI3K mRNA水平显著低于500 nmol/L组(P<0.05),提示姜黄素可抑制Notch1 和PI3K mRNA的水平,并体现一定的剂量依赖性;此外,姜黄素通过Notch1途径调控PI3K mRNA水平,影响PC-3细胞体外生长。见图5、图6、图7。

3 讨论

姜黄素作为一种传统的植物药物,已在中国和印度有超过2000年的应用历史。在多种慢性疾病的治疗中,姜黄素已被证实具有重要的药理效应,包括炎症,风湿,代谢紊乱,肝脏疾病,肥胖,神经退行性疾病和一些恶性肿瘤[10-12]。截止2018年,在国内外已发表的姜黄素有关的研究论文中(来源于pubmed检索),37% 的文章都是与肿瘤相关的研究[13]。肿瘤是目前发达国家位居第一位的死亡因素,尽管近年来早期诊断和多种治疗措施的应用,有效降低了肿瘤引起的死亡率,但肿瘤耐药性等因素依然是目前面临的巨大难题,严重影响了临床的治疗效果。研究已发现,姜黄素自身具有一定的抗肿瘤效应,同时联合应用姜黄素,还可以显著提高其他抗肿瘤手段的临床治疗效果,通过影响不同的信号通路,增加放疗敏感性或化疗敏感性[14-16]。体内外实验表明[17],姜黄素可以显著抑制肝癌细胞的增殖,影响细胞周期和细胞凋亡。此外,研究[18]还发现,姜黄素能够影响血管的生成,从而可以调控肿瘤血管生成的过程。据报道,姜黄素可调控p53、NF-kB、MAPK、Nrf2等信号通路,影响结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、口腔癌等恶性肿瘤的病理进程。姜黄素可以显著降低IkB 激酶的磷酸化水平,阻止NF-kB亚单位p65的核转录作用,减少IL-6和IL-11等细胞因子的分泌,抑制NF-kB活性,影响肿瘤细胞的凋亡,增殖等过程。前列腺癌是常见的恶性肿瘤,研究前列腺癌的分子机制,寻找新的治疗靶点和治疗手段,提高临床疗效,减轻常规化疗药物和放射治疗引起的副作用,对于改善患者生存质量,具有重要的临床意义。

研究[19-20]证实,在肿瘤的发生和发展过程中,Notch信号通路参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡等过程,相关的分子在上述通路中扮演着重要的作用。Notch受体是以异源二聚体形式存在的膜蛋白分子[21]。研究[22]还发现,Notch1分子在肿瘤细胞中表达增高,针对肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等,Notch分子均参与调控上述过程。在淋巴瘤的发展进程中,Myc可以与Notch1相互协同,促进肿瘤细胞的体外增殖,这一过程与MAML突变有关。此外,PI3K-AKT-mTOR 和MEK-ERK途径与Notch1分子的表达水平密切相关,影响肿瘤的生长。PI3K-AKT-mTOR是Notch1分子下游信号途径,Notch1通过上述途径调控肿瘤细胞的体外生长状态。因此,寻找与Notch1分子作用相关的多酚类物质,有望影响肿瘤细胞的体外增殖等过程,具有一定的临床意义。但是否姜黄素可以影响前列腺癌细胞中Notch1分子的水平,调控前列腺癌的发生和发展过程,目前尚未见相关报道,其分子机制有待进一步阐明。

本研究结果发现,不同剂量的姜黄素可以抑制PC-3细胞的增殖,并具有一定的剂量依赖性。此外,姜黄素可以诱导PC-3细胞凋亡的发生,显著增加PC-3细胞凋亡率,这一效应可能与Caspase活性有关。经过姜黄素处理的PC-3细胞,其Caspase-3和Caspase-9活性显著增加。我们的结果还证实,PC-3细胞中Notch1 和PI3K mRNA高表达。PC-3细胞中Notch1和PI3K mRNA水平较高,经过姜黄素处理的PC-3细胞,可显著降低Notch1 和PI3K mRNA水平和蛋白表达,体现一定的剂量依赖性。提示,姜黄素可能通过对Notch1分子的抑制效应,调控PI3K水平,影响前列腺癌细胞的体外生物学特点,但具体的分子机制仍需要进一步的研究来证实。

4 结论

本研究结果表明,姜黄素可以影响前列腺癌细胞增殖、凋亡等过程,可能为临床前列腺癌的化疗提供新的策略和实验依据。

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