三七总皂苷对快速老化SAMP8小鼠PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信号通路的影响*

陈文兵 田新 吴登攀 钟振国 黄金兰

(1. 徐州医科大学药学院，江苏 徐州 221004；2. 广西中医药大学科学实验中心，广西 南宁 530200)

老年痴呆(Senile dementia，SD)是老年期发生的以记忆障碍、失语、失认、失用和行为改变为主要临床特征的一类疾病，包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、血管性痴呆(Vascular dementia，VD)，混合型痴呆(Mixed dementia)和其他类型痴呆(Other dementia)，其中AD是该类疾病的主要类型[1-4]。现代医学认为SD是多因素引起的一种原发性大脑神经退行性病变，患者海马神经元缺失而认知能力下降。 PI3K/Akt是抑制细胞凋亡和促进细胞存活的重要信号通路，激活PI3K/Akt信号通路可发挥神经保护作用[5-6]。PLCγ1被认为是一个与细胞增殖和分化有重要关系的分子，广泛分布于中枢神经系统，PLCγ1催化分解的1，2一二酞基甘油(DAG)产物可激活PKC，PKC活化与细胞的增殖、分化、凋亡等多种生物学效应有密切关系[7]。三七总皂苷(PNS)是三七的活性成分，前期研究显示PNS具有明显改善快速老化痴呆模型小鼠SAMP8(以下简称SAMP8)的学习记忆能力[8]，然而，其机制尚不清楚。本研究拟探讨PNS对PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信号通路的影响，以期为PNS治疗SD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取3月龄雄性SAMP8 30只，体重20～30 g；SAMR1小鼠(与SAMP8同一来源阴性鼠，3月龄)10只，均由中国医学科学院实验动物研究所提供[动物合格证号：SCXK (京)2014-004]。实验动物饲养在SPF级动物房内。实验方案经徐州医科大学实验动物道德伦理委员会批准。

1.2 实验仪器 Light Cycle 480荧光定量 PCR 仪(Roche公司)；NanoDrop 1000核酸浓度测定仪(Thermo Scientific 公司)；Elx 808酶标仪(BioTek公司)；VE 180 Tanon 垂直电泳系统(上海天能科技有限公司)；半干转印系统(Bio-Rad公司)；V37扫描仪(EPSON 公司)；BX43F正置荧光显微镜(OLYMPUS 公司)。生物组织自动脱水机、包埋机、切片机(金华科迪仪器设备有限公司)。

1.3 实验药品与主要试剂 三七总皂苷(PNS，云南云科药业有限公司，批号：140115)；IRDye 800CW goat anti-rabbit TgG (Li-cor公司，货号：926-32211)；ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo公司，货号：FSQ-101)；TRIzol® Reagent (Life Technologies公司，货号：15596-026)；PI3K抗体(Santa Cruz公司，货号：sc-292114)；p-Akt抗体(Cell Signaling 公司，货号：4060S)；Akt抗体( Cell Signaling 公司，货号：4691S)；β-actin 抗体(Bioworld 公司，货号：AP0060)；p-PLCγ1抗体(Cell Signaling 公司，货号：14008S)；PLCγ1抗体(Cell Signaling 公司，货号：5690S)；尼氏(Nissl)染色液(Beyotime，C0117)；PKC Kinase Activity Assay Kit (abcam公司，货号：ab139437)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组与给药 SAMP8小鼠随机分为模型组、PNS高剂量组(200 mg·kg-1)和PNS低剂量组(100 mg·kg-1)，每组10只。药物组每日给予药物灌胃一次，对照组(SAMR1组)和模型组每日给予相同体积的生理盐水，连续给药2个月。

1.4.2 尼氏染色法观察海马形态 大脑组织灌注后浸于4%多聚甲醛48 h，脱水、石蜡包埋，切片常规脱蜡至水化，置入尼氏染色液10 min，自来水冲洗，二甲苯透明，中性树胶封片。染色切片在光学显微镜下随机选取5个视野拍片，观察海马CA1区锥体细胞形态。

1.4.3 酶活性试剂盒检测PKC的活性 采用 Kinase Activity Assay Kit试剂盒检测大脑PKC的活性，具体操作严格按照试剂盒说明进行。取新鲜大脑组织，加入RIPA裂解液于冰上充分裂解后，低温离心取上清，BCA法检测样本的蛋白浓度。PKC 孔板每孔加入50 μL 激酶溶液，放置10 min后弃液，每孔加入含2 ug样本质量的激酶溶液，再加入10 μL/孔ATP，封膜30℃恒温孵育90 min。弃液，加入40 μL/孔磷酸化底物抗体常温孵育60 min后，洗涤4次，加入40 μL/孔辣根过氧化物常温孵育30 min后再洗涤4次，加入60 μL/孔TMB底物常温孵育50 min后加入终止液，于450 nm波长处测定各孔的吸光度，按公式计算PKC活性。蛋白激酶C的相对活性=(样本吸光度-空白吸光度)/ 每孔蛋白质量。

1.4.4 实时定量PCR检测小鼠脑内PI3K、Akt、 PLCγ1和PKC mRNA的含量 采用TRIzol法提取小鼠大脑的RNA，检测其浓度和纯度。按逆转录说明书反转录成cDNA备用。根据小鼠PI3K、Akt 、PLCγ1和PKC基因序列，由上海生工生物公司设计合成上、下游引物序列(见表1)。在Roche LightCycler® 96荧光定量PCR仪上进行扩增反应。以ACTB为内参，按 2-ΔΔCt法计算各目的基因mRNA的相对表达水平。

1.4.5 免疫印迹法测定PI3K，p-Akt (Ser473)、Akt、p-PLCγ1 (Tyr783)和 PLCγ1 蛋白的表达水平 大脑组织加入适量裂解液，冰浴电动匀浆，4℃，12000 r/min离心10 min，收集上清液，BCA法检测蛋白浓度。蛋白样本经SDS-PAGE 电泳、转膜、5%BSA封闭后，加入一抗(PI3K：1：500，p-Akt：1：2000，Akt：1：1000，p-PLCγ1：1：1000，PLCγ1：1：1000，β-actin：1：2000)4℃摇床上孵育过夜，次日加入荧光二抗(1：10000)孵育1 h，TBS清洗后EPSON扫描仪扫描图像，用Image J软件对蛋白条带进行灰度分析。

2 结果

2.1 海马CA1区神经元形态观察 尼氏小体在光学显微镜下为嗜碱性深染的颗粒或小块，分布于神经元胞体和树突中。经尼氏染色后呈蓝紫色。尼氏小体大而数量多，说明神经细胞合成蛋白质的功能较强；相反在神经细胞受到损伤时，尼氏小体的数量会减少甚至消失。对照鼠海马CA1区锥体细胞数量多，结构完整，排列规整，尼氏小体染色均一，SAMP8海马CA1区锥体细胞数量减少，排列紊乱，形态不规整，有断层，尼氏小体细胞数量明显减少。PNS给药组CA1区锥体细胞排列整齐形态正常，尼氏着色较均一且数量明显增多。见图1。

2.2 PNS对SAMP8脑内PKC活性的影响 与对照组比较，模型组的 PKC活性有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，PNS低、高剂量组的 PKC活性明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。结果提示，PNS可以提高SAMP8小鼠大脑PKC活性。见图2。

2.3 PNS对SAMP8脑内PI3K、Akt、PLCγ1和PKC mRNA的含量的影响 与对照组相比，模型组的PI3K、Akt 和PKC mRNA的含量显著升高(P<0.05)；与模型组相比，PNS高、低剂量组的PI3K、Akt mRNA表达水平显著提高(P<0.05)；PNS高剂量组PLCγ1和PKC mRNA表达水平亦显著增高(P<0.05)。提示PNS可提高SAMP8小鼠脑内PI3K/Akt通路及PLCγ1/PKC通路基因表达。见图3。

2.4 PNS对SAMP8脑内PI3K，p-Akt (Ser473)、Akt、p-PLCγ1 (Tyr783)和 PLCγ1 蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组小鼠脑组织PI3K、p-Akt 和p-PLCγ1蛋白表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，PNS高、低剂量组上调SAMP8 小鼠脑组织PI3K、p-Akt和 p-PLCγ1蛋白表达(P<0.01)；各给药组小鼠脑组织Akt和PLCγ1总蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明，PNS可激活PI3K/Akt通路及PLCγ1通路。见图4～6。

3 讨论

SD的主要特征是进行性记忆和学习功能障碍。海马是中枢神经系统中与学习记忆和情绪功能密切联系的脑区，海马神经元的损伤可导致认知功能障碍[9-13]。前期研究已经证实，PNS可以改善SAMP8小鼠的行为记忆能力[8]。然而PNS对SD神经元损伤的影响及其机制目前尚不清楚。本研究结果显示，PNS可显著减轻SAMP8小鼠神经元损伤，该作用可能与PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信号通路有关。

尼氏小体是合成更新细胞器所必需的结构蛋白及合成神经递质所必需的酶类，可作为神经元功能状态的标志。当神经元受损时，尼氏小体数目减少、解体甚至消失[14-19]。因此尼氏染色是神经元特异染色实验方法。由本实验的尼氏染色结果显示，对照组小鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐，尼氏小体数量多，染色均一，模型组海马CA1区锥体细胞数量明显减少，排列紊乱，有断裂，尼氏染色不均一，而PNS给药后，CA1区神经元细胞形态均有不同程度的恢复，尼氏小体数量增加，着色均一，这说明PNS可以减轻SAMP8小鼠海马神经元的损伤。

AD是SD的主要类型。研究发现，PI3K/Akt信号转导通路是参与细胞凋亡过程的经典信号通路，PI3K/Akt信号通路及其调节因子的异常表达与AD病人细胞凋亡有密切联系[20-23]。研究报道Aβ可以通过抑制PI3K/Akt信号途径而减轻神经元损伤，并改善动物学习记忆障碍[24]。PLCγ1被各种细胞因子激活水解产生肌醇3磷酸和甘油二酯两种胞内产物，甘油二酯可激活PKC，从而发挥抗凋亡作用而促进细胞存活[25]。PLCγ1和PKC在AD患者脑内表达降低。因此，PLCγ1/PKC信号通路可能在AD细胞凋亡中发挥调控作用。为了探讨PNS对PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信号通路的影响，本研究主要从基因和蛋白水平上检测了PI3K/Akt和PLCγ1/PKC相关基因和蛋白的表达水平。研究结果显示，模型组SAMP8脑内PI3K、p-Akt、p-PLCγ1 蛋白表达明显下降，而PNS均能不同程度的提高PI3K、Akt 、PLCγ1和PKC mRNA含量和上调PI3K、p-Akt 和p-PLCγ1蛋白表达。这提示PNS抑制神经元损伤可能与其激活PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信号通路有关。

4 结论

PNS可以减轻SAMP8小鼠海马神经元的损伤，这可能与其激活PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信号通路有关。