辛伐他汀对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的干预效果及作用机制*

孙威 宫政 翟悦 袁媛媛

(沈阳市骨科医院药剂科，辽宁 沈阳110044)

脑血管疾病为临床常见、多发疾病，其较高的致残、致死率严重威胁人类生活质量及生命健康[1]。临床资料显示，脑缺血起病急、进展快，其卒中发病率占全部卒中发病率的75%以上，且呈年轻化趋势[2]。资料[3]表明，脑缺血-再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)发病机制较为复杂，且多因素参与并涉及多个作用环节，其相互作用，引发系列级联反应。目前，临床尚无特效治疗药物，因此寻找高效低毒的新药仍作为脑神经领域的研究热点。随研究深入发现，辛伐他汀对脑CIRI具有一定保护作用，但临床尚不清楚其防治CIRI的作用机制，且有关辛伐他汀对脑缺血再灌注损伤研究报道较少[4-5]。本研究通过建立脑缺血再灌注损伤模型给予辛伐他汀干预，旨在探讨其对脑缺血再灌注损伤的干预效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取40只健康SPF级SD雄性大鼠，体重210～239 g，平均体重(224.5±12.3)g，由山东鲁抗医药股份有限公司(合格证号：SCXK 鲁20130001)提供。实验动物于术前自由饮食、饮水，饲养环境恒温湿度45%～55%，温度(20.54±2.00)℃，12 h循环光照，维持基础状态。实验结束后，本研究所选取大鼠处理方法均符合动物伦理处置要求，且本研究获我院伦理委员会批准。

1.2 动物模型制备及分组 参照Longa等[6]研究中大脑中动脉栓塞再灌注模型制备方法，并进行改良。手术前夜禁食，采用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，在颈部作一正中切口，分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉。于总动脉开口处将预先处理好的尼龙线(长4 cm，线直径0.26～0.28 mm，头端直径0.36 mm)缓慢插入颈内动脉入颅方向，以颈总动脉分叉处为标记，插入深度1.8～2.1 mm稍感阻力停止，阻断大脑中动脉所有血液供应，实现右侧大脑中动脉栓塞缺血，2 h后退出线栓是大脑中动脉再通，实现大脑中动脉的缺血后再灌注。注意术中室温严格控制在23℃～25℃。建模过程中死亡3只，成功27只，随机分为模型组、小剂量组、高剂量组，每组9只，对各组大鼠分别进行干预，参考人与动物体表面积等效剂量比值，计算大鼠给药剂量，以1/2等效剂量为小剂量，2倍为高剂量，小、高剂量组大鼠分别尾部静脉注射20 mg/kg、40 mg/kg辛伐他汀，正常组、模型组大鼠给予等剂量生理盐水干预。

1.3 标本采集、HE染色 干预1周后对大鼠行麻醉处理，断头法处死，取出脑组织，剪取部分脑组织制备匀浆液。取大鼠海马区脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，完全浸泡，5%酸钠脱钙处理，24 h后常规包埋、切片处理，以不同浓度酒精进行复水。苏木精染色15 min，后以1%伊红染色，封片处理后以显微镜进行观察。

1.4 指标评估

1.4.1 脑组织含水量、脑梗死体积、神经功能损伤程度评估 脑组织含水量：再灌注72 h后将大鼠处死，取出梗死侧大脑半球，称重脑组织湿重后置于100℃烤盘内烘烤至恒重，后称量脑组织干重。脑组织含水量=[(湿重-干重)/湿重]×100%。脑梗死体积：每组随机选取6只大鼠麻醉处死，将脑组织切成2.0 mm切片并浸入2% TTC内30 min，将染色处理脑梗死组织呈灰白色，正常脑组织呈玫瑰红色。将切片于4%多聚甲醛内固定，以Image J图像分析系统计算脑梗死体积。脑梗死体积百分比=(正常侧半球体积-梗死侧肺梗死去大脑半球体积半球面积)/正常侧大脑半球体积。神经功能损伤程度：采用改良Lon-ga五点量表评分系统对大鼠神经功能损伤进行评估。0分无神经功能障碍；1分为尾巴提起后向对侧前肢屈曲；2分为行走时原地打转，静止时身体未偏向对侧；3分为行走时实原地打转，静止时身体偏向对侧；4分为严重意识障碍，无法自发行走。

1.4.2 Morris水迷宫实验 备圆形水池，直径150 cm、高50 cm，分别标记4个点位，注入半池水，水温27℃。在水池中央放入一个高30 cm、直径10 cm平台。于再灌注第5 d开始实验，共进行5 d。前4 d将大鼠面朝水池内壁放于水中，并开始摄像记录。大鼠找到站台并停留30 s，若找不到站台则用引导棒引导至站台停留30 s。将大鼠移出，30 s将大鼠以同样方式放入另一个象限，直至4个象限全部完成。记录潜伏期(找到站台时间)。第5 d撤除平台，记录大鼠在60 s内第三象限活动时间及穿越站台次数。潜伏期越短，第三象限活动时间和穿越次数越多，表明大鼠学习、记忆能力越强。

1.4.3 双抗体夹心ELISA法检测脑组织匀浆液白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平各组细胞置于室温后，标记酶标板，制作标准品，然后取出试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，按照1：2比例稀释样品；于每孔内加入100 μL已稀释好的待测血清和标准品，37℃恒温孵育箱中湿育2 h；后以专用的洗涤液重复洗涤反应板，再加入1：100稀释的抗体工作液100 μL/孔，37℃恒温孵育箱中湿育45 min；继续清洗反应板4次后，在反应孔内加入IL-1β、TNF-α、hs-CRP、GSH-Px、SOD、MDA溶液100 μL/孔，置于37℃恒温孵育箱中湿育45 min后在反应孔内加入终止液100 μL/孔终止反应，分别用酶标仪在450 nm波长测定IL-1β、TNF-α、hs-CRP、SOD水平，340 nm波长测定GSH-Px含量，532 nm波长测定MDA含量。

2 结果

2.1 大鼠脑组织病理图 正常组：脑组织结构完好，细胞核清晰可见；模型组：存在明显炎性细胞浸润情况；小剂量组：可见炎性细胞浸润情况，脑组织结构较为完整；高剂量组：炎性细胞亲润情况相对较轻，细胞排列较为规则。见图1。

2.2 各组大鼠脑组织含水量、脑梗死体积、神经功能损伤评估 相比正常组，模型组大鼠脑组织含水量升高，差异有统计学意义(P<0.05)；相比模型组，小剂量组、高剂量组大鼠组织含水量、脑梗死面积、神经功能损伤评分较低，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组大鼠脑组织含水量及神经功能损伤评估

2.3 各组大鼠学习记忆能力评估 与正常组相比，模型组、小、高剂量组大鼠各时间点躲避潜伏期较长，第三象限活动时间、穿越站台次数较低，差异有统计学意义(均P<0.05)；相比模型组、小剂量组，高剂量组大鼠各时间点躲避潜伏期较低，第三象限活动时间、穿越站台次数较高，差异有统计学意义(均P<0.05)。 见表3。

表3 Morris水迷宫实验Table 3 Morris water maze test

2.4 各组炎性因子水平比较 与正常组相比，模型组大鼠IL-1β、TNF-α、hs-CRP水平升高，差异有统计学意义(均P<0.05)；相比模型组、小剂量组，高剂量组大鼠IL-1β、TNF-α、hs-CRP水平较低，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表4。

表4 各组炎性因子水平比较Table 4 Comparison of inflammatory factors in each group

2.5 GSH-Px、SOD、MDA水平比较 与正常组相比，模型组大鼠GSH-Px、SOD水平较低，MDA水平较高，差异有统计学意义(均P<0.05)；相比模型组、小剂量组，高剂量组大鼠GSH-Px、SOD水平升高，MDA水平降低，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表5。

表5 GSH-Px、SOD、MDA水平比较Table 5 Comparison of GSH Px，SOD and MDA levels

3 讨论

临床实践证实，脑缺血再灌注损伤作为影响治疗效果的重要危险因素，与炎症反应、氧化应激及兴奋性氨基酸毒性等多种机制相关。相关学者指出，脑缺血再灌注的主要治病机制与炎性反应与氧化损伤的发生密不可分[7-8]。

本研究发现，辛伐他汀可改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能及认知能力。研究指出，辛伐他汀凭借良好抗炎、抗氧化效果被广泛应用于脑缺血性疾病中，对改善神经功能损伤、降低短暂性缺血及卒中的死亡率具有重要意义[9-12]。杨晓炜等[13]研究中证实，他汀类药物可改善大鼠脑缺血再灌注损伤，减轻神经损伤程度，提高认知能力。本研究结果显示，以辛伐他汀对脑缺血再灌注损伤大鼠进行干预，大鼠神经功能损伤、梗死体积降低、Morris水迷宫实验潜伏期降低、活动时间及平台穿越次数增加，形成此结果的原因可能与辛伐他汀良好的神经保护作用相关。由此得出，辛伐他汀对脑缺血再灌注损伤具有良好的干预效果。

本文研究发现，辛伐他汀可有效抑制脑缺血再灌注损伤产生的炎性反应及氧化应激反应。研究表明，炎症反应、氧化应激反应在脑缺血再灌注损伤中扮演重要角色[14-16]。IL-1β、TNF-α、hs-CRP等作为典型炎性因子，其异常表达激活大量炎症介质，使得炎症反应加重造成脑组织损伤、坏死，形成梗死灶。而血清hs-CRP更被认为是缺血再灌注损伤发生的独立预测指标[17-18]。相关研究[19-20]证实，TNF-α、hs-CRP参与大鼠脑缺血再灌注损伤的发生、发展。通过给予阿托伐他汀干预，TNF-α、hs-CRP水平降低，且随剂量增加对炎症的抑制作用升高，与本文研究内容相符，但因干预措施、样本纳入量不同等因素影响，研究结果可能存在一定偏倚。脑梗死发生后细胞、自由基等发生系列病理生理变化，加重功能损伤[21-23]。研究证实，脑组织在氧化应激条件下受到抗氧化酶保护，有效清除有害自由基。自由基在缺氧缺血状态下的生成速度超过机体清除速度造成氧化应激损伤[24-25]。本研究结果显示，通过辛伐他汀干预脑缺血再灌注损伤大鼠，IL-1β、TNF-α、hs-CRP、MDA水平降低，GSH-Px、SOD水平升高，提示辛伐他汀可有效抑制脑缺血再灌注损伤产生的炎性、氧化应激反应，发挥良好的抗炎、抗过氧化作用。由此得出，辛伐他汀对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用可能与影响、调节炎性反应及氧化应激反应相关。

4 结论

辛伐他汀能够减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，缩小梗死面积，提高神经功能，形成这种保护作用可能与抑制炎症和抗过氧化损伤相关，为抗脑缺血再灌注损伤药物研究提供重要理论依据。但本研究样本量较小、观察时间有限，未对不同再灌注时间及药物使用剂量进行研究，需进一步增加样本量对干预效果进行深入研究。