酸枣仁皂苷A对小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖与分化的影响*

张兵 朱亚辉 王孝玉 周思私 袁法

(南充市中心医院骨科， 四川 南充 637000)

骨折指骨骼因直接或间接原因造成完整性破坏或连续性中断，是一种常见临床医学疾病，可以通过治疗恢复到原有的骨形态，如果不及时治疗，会使骨折难以愈合，最终导致骨形态的畸形[1]。骨折愈合是一个非常复杂的动态生物过程，该过程涉及多种骨细胞、细胞因子和基因的相互作用，最终使骨组织恢复原有的结构和骨功能[2]。虽然骨骼愈合能力较强，但由于病因复杂，骨折类型多样，有5%～10%的骨折患者在愈合过程中存在一定程度的障碍，导致骨折延迟愈合或骨不愈合，给患者造成身体不适。因此，明确骨折愈合的生理过程及其调控机制将有助于临床上治疗骨折[3-4]。

酸枣仁是植物酸枣的天然种子，在中国、日本、韩国等东方国家已有上千年的用药历史。酸枣仁皂苷A已被证明是酸枣仁的主要活性成分，既往研究表明酸枣仁皂苷A具有抗氧化、抗焦虑、抗炎和减少细胞凋亡等作用[5-6]，但目前关于酸枣仁皂苷A对骨细胞细胞增殖和分化的研究与报道鲜少。因此本实验采用小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)模拟骨组织生成与分化，探讨酸枣仁皂苷A是否能通过促进成骨细胞增殖和分化，从而加快骨组织愈合速度，为临床上治疗骨折提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 试剂 酸枣仁皂苷A，纯度≥98%，购自成都曼思特生物科技有限公司；胎牛血清、α-MEM培养基、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒均购自美国Gibco公司；CCK-8检测试剂盒，碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)Elisa检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒、RNA逆转录试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；生长转化因子-β1(TGF-β1)、胶原蛋白I (Col I)、骨成型蛋白-2(BMP-2)和β-肌动蛋白(β-actin)抗体均购自艾博抗(上海)贸易有限公司；所有引物及序列由上海生工股份有限公司提供。

1.3 仪器 MultiskanTMFC酶标仪、VeritiPro PCR仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]、GX53倒置显微镜(日本Olympus公司)、多功能凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)、蛋白质电泳仪(美国Bio-Rad公司)、CytoFLEX S流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)。

1.4 主要实验方法

1.4.1 MC3T3-E1细胞的培养 将复苏后的MC3T3-E1细胞置于含α-MEM培养基(10%胎牛血清)的培养瓶中，在37℃，5%CO2的培养箱中进行培养，中途更换培养基1～2次，待细胞生长至80%铺满培养瓶底后，使用胰酶消化进行传代备用。

1.4.2 CCK-8检测细胞增殖率 收集处于生长对数期的MC3T3-E1细胞进行分组：空白组、酸枣仁皂苷A组(5、10、20、40 mg/L)，调整细胞密度为每100 μL约含1×104个细胞，接种至96孔板中过夜培养至贴壁，每组重复3次。待细胞贴壁后加入药物并调整至对应的终浓度，空白组加入等量的完全培养基，添加药物后在培养箱中继续培养48 h，然后加入10 μL CCK-8试剂，在室温下孵育1 h，使用酶标仪在450 nm波长下检测吸光度值并计算细胞增殖率。

1.4.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集处于生长对数期的MC3T3-E1细胞进行分组：空白组(完全培养基)、无血清对照组(不含血清的培养基)、酸枣仁皂苷A组(5、10、20、40 mg/L+不含血清的培养基)，调整细胞密度为1×103个/mL接种于6孔板中，每组重复3次。待细胞贴壁后加入药物并调整至对应的终浓度，继续培养48 h，按Annexin V-FITC试剂盒说明书提取操作，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4.4 Von kossa染色法检测细胞矿化结节生成程度 收集处于生长对数期的MC3T3-E1细胞分组：空白组、酸枣仁皂苷A组(5、10、20、40 mg/L)。先将盖玻片预先置于6孔板中，然后将细胞密度调整为1×104个/mL接种于6孔板上，细胞贴壁后，空白组不加药物，酸枣仁皂苷A组加入对应药物继续培养，每2 d更换一次培养基，持续诱导21 d。21 d后取出预置盖玻片进行Von kossa法染色并在显微镜下拍照观察。

1.4.5 Elisa法检测细胞中ALP与BGP的水平 MC3T3-E1细胞成骨诱导21 d后用PBS清洗干净，按Elisa试剂盒说明书进行操作，然后使用酶标仪进行检测，计算各组细胞中ALP与BGP的水平。

1.4.6 实时荧光定量集合酶链式反应(RT-qPCR) MC3T3-E1细胞成骨诱导21 d后用PBS清洗干净，按RNA提取试剂盒与RNA逆转录试剂盒说明书进行RNA提取与逆转录，然后使用RT-PCR仪计算各组样本的CT值，采用2-△△CT法表示成骨特异性转录因子2(Runx-2)与骨钙素(BGP)的相对表达水平。

1.4.7 蛋白质免疫印迹(Western Blot) MC3T3-E1细胞成骨诱导21 d后用冰PBS清洗干净，按蛋白质提取试剂盒说明书操作进行蛋白质提取与定量，然后依次进行凝胶电泳、转膜、封闭，一抗(TGF-β1(1：500)、Col I (1：500)、BMP-2(1：500)与β-actin (1：1200))过夜孵育，二抗(1：5000)中孵育2 h，然后使用ECL试剂盒进行显影，将膜置于凝胶成像系统中进行发光分析，以β-actin作为内参，灰度值反映表达水平。

2 结果

2.1 酸枣仁皂苷A对MC3T3-E1成骨细胞的影响 与空白组相比，10～40 mg/L的酸枣仁皂苷A组对MC3T3-E1细胞有促进增值的作用，增殖效果随浓度的升高而增强，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。与无血清对照组相比，5～40 mg/L酸枣仁皂苷A组能显著降低MC3T3-E1细胞的凋亡率(P<0.05)，抑制凋亡的效果随浓度的升高而增强，见表2、图1。

表1 不同浓度的酸枣仁皂苷A对MC3T3-E1细胞增殖率的影响

表2 不同浓度的酸枣仁皂苷A对MC3T3-E1细胞凋亡率的影响

2.2 酸枣仁皂苷A对MC3T3-E1成骨细胞矿化结节生成的影响 与空白组相比，5～40 mg/L酸枣仁皂苷A组能显著促进MC3T3-E1细胞中矿化结节的生成(均P<0.05)，结节生成数量随浓度的升高而增多，见表3、图2。

表3 酸枣仁皂苷A组对MC3T3-E1细胞矿化结节生成的影响

2.3 酸枣仁皂苷A组对MC3T3-E1成骨细胞分化的影响 与空白组相比，20～40 mg/L酸枣仁皂苷A组能显著提高MC3T3-E1细胞中ALP的水平(P<0.05)，10～40 mg/L酸枣仁皂苷A组能显著提高MC3T3-E1细胞中BGP的水平(P<0.05)，分化因子含量水平随浓度的升高而升高，见表4。

表4 酸枣仁皂苷A对MC3T3-E1细胞中ALP与BGP水平的影响

2.4 酸枣仁皂苷A对MC3T3-E1成骨细胞分化基因的影响 与空白组相比，10～40 mg/L酸枣仁皂苷A组能显著提高MC3T3-E1细胞中Runx-2基因的表达水平(P<0.05)，20～40 mg/L酸枣仁皂苷A组能显著提高MC3T3-E1细胞中BGP基因的表达水平(P<0.05)，基因表达水平随浓度的升高而升高，见表5。

表5 酸枣仁皂苷A对MC3T3-E1成骨细胞分化基因Runx-2与BGP表达的影响

2.5 酸枣仁皂苷A组对MC3T3-E1成骨细胞增殖与分化蛋白的影响 与空白组相比，5～40 mg/L酸枣仁皂苷A组能显著提高MC3T3-E1细胞中TGF-β1、Col I与BMP-2的蛋白表达水平(P<0.05)，3种蛋白表达水平随均浓度的升高而升高，见表6、图3。

表6 酸枣仁皂苷A对MC3T3-E1成骨细胞分化蛋白TGF-β1、Col I与BMP-2表达水平的影响

3 讨论

正常情况下，骨折愈合分为3个阶段：血肿期(炎症阶段)、骨痂期(修复剪断)以及重建期(骨重塑阶段)[7]。同时，骨愈合也是复杂的细胞和生化过程的结果，其中骨膜、周围软组织和髓质在骨组织之外发挥着积极作用[8]。因此成骨细胞的增殖、分化与成熟是骨折愈合的关键。酸枣仁皂苷A具有许多生物效应[9]，对许多细胞均有保护作用，有研究发现，酸枣仁皂苷A能促进血管平滑肌细胞增殖，调节氧化应激平衡保护细胞[10]。在本研究中，CCK-8实验结果说明酸枣仁皂苷A有保护成骨细胞的能力，为加快骨折愈合创造条件。

骨形成是由成骨细胞介导的，这些成骨细胞来自于骨髓间充质干细胞，被主转录因子Runx-2激活[11-12]。Runx-2可以促进成骨细胞分化，是决定成骨细胞分化方向的关键调控因子[13-14]。本研究对MC3T3-E1细胞进行酸枣仁皂苷A干预后，Runx-2基因表达增多，说明酸枣仁皂苷A可以通过上调Runx-2表达从而诱导骨细胞分化。成骨细胞分化的终末状态是骨细胞，当成骨细胞达到终末分化时，会分泌不同的基质蛋白来补充骨基质，如胶原蛋白-1(Col-1)、BGP、ALP等[15-16]。ALP产生磷酸钙沉积在成熟成骨细胞中，促进骨矿化，与BGP一起被用作骨形成的生物标志物，BGP水平的下降会导致骨代谢紊乱和骨结构异常[2，17]。本实验研究发现，酸枣仁皂苷A作用MC3T3-E1细胞后，BGP基因的表达水平升高，同时细胞中ALP与BGP的含量升高，细胞中矿化结节数量增多，说明MC3T3-E1被酸枣仁皂苷A干预后正在高度分化，释放出ALP与BGP，由此证明酸枣仁皂苷A有促进成骨细胞分化的能力。

骨形成蛋白(BMPs)在机体发育中发挥多种作用，参与骨发育和骨组织形成过程，具有较强的诱导分化和成骨能力[18-19]。BMPs主要通过典型的BMP信号通路发挥其生物学功能[20]。从成骨细胞形成骨痂，骨痂继续钙化使骨折达到临床愈合，这一过程通常会持续3～6个月，而骨痂被吸收完全形成骨板阶段会持续1～2年，这说明骨愈合是一个长期的生理过程。既往研究发现，转化生长因子(TGF)可通过转化发挥多种生物学作用，包括抑制组织凋亡、加速细胞分化、增加胶原含量、减少骨丢失[21-22]，也可以促进骨细胞的增殖，加速骨痂的形成，同时还能激活骨组织中纤维细胞的合成，增加胶原纤维含量，最终促进骨愈合[23]。前期研究发现，TGF/BMP信号通路参与骨形成，TGF-β1可以增强BMP-2诱导的成骨功能[24]。本实验结果显示，酸枣仁皂苷A作用MC3T3-E1细胞后，Col I、BMP-2与TGF-β1的蛋白表达水平明显升高，说明酸枣仁皂苷A可能通过激活TGF/BMP通路，促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化。

本实验证明了酸枣仁皂苷A对MC3T3-E1细胞无明显的毒性与抑制效果，而且能促进MC3T3-E1细胞增殖与在保证细胞在低营养环境下存活；通过Von kossa染色实验、Elisa实验与RT-qPCR实验证明酸枣仁皂苷A促进MC3T3-E1细胞分化与成熟，并加快成骨细胞转变为骨组织；最后通过蛋白质免疫印迹实验揭示了酸枣仁皂苷A促进MC3T3-E1细胞增殖与分化的机制激活了细胞中TGF/BMP通路。但本实验尚未进行动物体内实验进行进一步验证，且只针对单一信号通路进行研究，对酸枣仁皂苷A干预骨细胞与骨组织的机制还需设计实验进行探讨。

4 结论

酸枣仁皂苷A能促进MC3T3-E1成骨细胞增殖，减少细胞凋亡，提高细胞分化程度与成骨效率，其机制可能是通过调控TGF/BMP通路而发挥的。