淫羊藿素对人肝癌Hep-G2细胞增殖、凋亡的影响及作用机制

邬仁华 董猛 白娟 卿毅 李玲

(成都大学附属医院肿瘤科，四川 成都 610000)

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第五大癌症，具有发病率高和死亡率高的特点，中国患者数量及死亡率均居世界之首[1-2]。据统计，HCC患者5年生存率不足30%，尽管目前治疗肝癌的方法较多，但效果并不尽人意[3-4]。因此，HCC的预防以及治疗已成为癌症研究的热点。近年来，研究发现许多中药具有抗肿瘤的效果，不仅可以抑制肿瘤细胞的生长和转移，同时还具有副作用小的特点[5-6]。淫羊藿是药用价值极高的传统植物中药之一，具有抑菌、抗炎、抗肿瘤等诸多功效，其主要活性成分包含淫羊藿苷、淫羊藿素等[7]。其中，淫羊藿素被证实具有抑制肿瘤细胞侵袭和转移的能力，且与肿瘤细胞的凋亡可能也存在一定关系，已被用于抗子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌等多方面的研究[8]。目前，有关淫羊藿素对人肝癌Hep-G2细胞抗增殖及凋亡的作用机制仍在讨论中，为进一步研究淫羊藿素调控人肝癌Hep-G2的恶性生物学特征，本研究观察了淫羊藿素对人肝癌Hep-G2细胞增殖、凋亡的影响及其对相关基因的影响，旨在探讨其作用机制，以期为临床治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要细胞 Hep-G2细胞由中国科学院细胞库提供。

1.2 主要试剂与仪器 淫羊藿素(CSA：5240-95-9；批号：20190108)购自宝鸡市国康生物科技有限公司；细胞培养所需青霉素购自哈药集团制药总厂；培养基(名称：RPMI-1640培养基、DMEM基础培养)购自自赛默飞世尔科技公司；Bcl-2抗体(货号：sc-56015；批号：20190603)、Bax抗体(货号：sc-70407；批号：20190606)购自Santa Cruze Biotechnology 公司；Ki67抗体(货号：ab205718)购自Abcam中国公司；凋亡检测试剂盒购自杭州四季青生物工程材料有限公司；荧光分光光度计(型号：722)购自赛默飞公司；细胞培养箱购自美国Forma公司；台式低温离心机(型号：JIDI-16R)购自广州激迪仪器有限公司；光学显微镜(型号：NE-600)购自深圳市博视达光学仪器有限公司；蛋白电泳及转膜仪购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 将人肝癌Hep-G2细胞培养于RPMI-1640培养基中，在培养基中添加100 U/ml 青霉素和100 U/ml链霉素，放入细胞培养箱内培养，培养箱设置为37℃恒温，调整CO2浓度为5%。

1.3.2 分组干预 将细胞分为：空白对照组，低、中、高剂量组，低、中、高剂量组分别使用2.5、5、10 μM/L的淫羊藿素处理。

1.3.3 MTT法检测细胞的增殖情况[9]将各组对数生长期人肝癌Hep-G2细胞以5000个/空接种于96个孔板中，贴壁生长后分别用 0、0.05、0.5、5、50 μM/L的淫羊藿素RPMI-1640培养液继续培养72 h，加入MTT溶液后使用DMSO溶解使用分光光度计检测570 nm波长处的光密度值，并计算细胞的抑制率，抑制率(%)=[(1-药物组A值)/空白对照组A值]×100%。

1.3.4 Western blot检测蛋白表达水平 取上述培养的肝癌Hep-G2细胞，使用恒温离心机在4℃的恒温条件下离心10 min，加入裂解液后再加入Loading Buffer 缓冲液。测定蛋白浓度后，电泳提取总蛋白并将蛋白转移到PVDF膜后加入一抗液中孵育过夜。加入Ki67(稀释倍数1：500)、Bax (稀释倍数1：500)、Bcl-2(稀释倍数1：500)、Caspase-3(稀释倍数1：500)；以β-actin (稀释倍数1：1000)为内参蛋白，采用Imaging System软件分析各组条带灰度值，依据相对灰度值进行统计学分析。

1.3.5 克隆形成实验检测Hep-G2细胞增殖情况[10]取上述细胞，在每个孔板中加入2.6 mL溶液并调节细胞浓度至1×103个/mL，十字轻轻晃动使细胞分散均匀。将细胞培养皿放入37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养2周后使用结晶紫染色计算克隆形成率。克隆形成率(%)=(克隆数/所种细胞数)×100%。

1.3.6 流式细胞仪检测Hep-G2细胞凋亡情况[11]取上述细胞，4℃恒温1000 r/min离心5 min，PBS洗涤2遍，弃上清液，加入试剂盒中的缓冲液混匀，再加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI混合，4℃避光孵育20 min，采用流式细胞仪进行上样检测，CellQuest软件分析计算Hep-G2细胞凋亡率。避光孵育15 min后上机检测细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 MTT结果 当使用淫羊藿素剂量为0.05 μM/L时候抑制率为4.00%；当使用淫羊藿素剂量为0.5 μM/L时候抑制率增加至13.00%(P<0.05)；当使用淫羊藿素剂量为5 μM/L时候抑制率增加至48.30%(P<0.05)；当使用淫羊藿素剂量为50 μM/L时候抑制率增加至89.50%(P<0.05)，见图1。

2.2 相关增殖蛋白表达情况 与空白对照组相比，低剂量组Ki-67蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05)；与低剂量组相比，中剂量组Ki-67蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05)；与中剂量组相比，高剂量组Ki-67蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05)，见图2。

2.3 克隆形成实验检测细胞增殖情况 由克隆形成实验可以看出，与空白对照组克隆形成率[(78.00±6. .00)%]相比，低剂量组克隆形成率[(60.50±4.05)%]显著降低(P<0.05)；与低剂量组相比，中剂量组克隆形成率[(43.50±2.00)%]显著降低(P<0.05)；与中剂量组相比，高剂量组克隆形成率[(20.00±2.00)%]显著降低(P<0.05)，见图3。

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 由流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡情况可以看出，相比空白组细胞凋亡率(8.90±9.00)%，低剂量组细胞凋亡率[(24.60±4.90)%]显著上升(P<0.05)；相比低剂量组，中剂量组细胞凋亡率[(52.39±6.00)%]显著上升(P<0.05)；相比中剂量组，高剂量组细胞凋亡率[(79.36±10.00)%]显著上升至(P<0.05)，见图4。

2.5 凋亡相关蛋白表达情况 由蛋白质印记实验可以看出，与空白对照组相比，低剂量组促凋亡蛋白Bax、Caspase-3蛋白相对表达水平显著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达量显著降低(P<0.05)；与低剂量组相比，中剂量组中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3相对表达水平显著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达水平显著降低(P<0.05)；与中剂量组相比，高剂量组促凋亡蛋白Bax、Caspase-3相对表达水平显著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达水平显著降低(P<0.05)，见图5。

3 讨论

肝癌是临床较为常见的肿瘤之一，起病隐匿，早期并无典型临床症状，但发病后病情进展迅速，对患者的生命安全造成巨大威胁[12]。尽管随着医学技术的不断发展，肝癌的诊断及治疗手段已取得一定进展，但仍有部分患者的临床结局较差。因此，对肝癌患者死亡率的控制仍然是医学工作中的一个难点，探索新的治疗药物有重要的积极意义。

近年来，使用中药治疗肝癌具有较好的效果。淫羊藿是传统中药中的一味补益药材，其作为传统中药用于治疗各类疾病已有悠久历史。早期研究发现，淫羊藿具有保护心脑血管、提高人体免疫力、促进骨代谢等功能，近年来有学者报道，其除了在内分泌、免疫系统方面发挥效用外，还具有抗肿瘤作用[13]。现代药理研究表明[14]，淫羊藿中的一种重要活性成分——淫羊藿，能抑制多种肿瘤细胞的增殖、转移，诱导肿瘤细胞凋亡，因此被认为是一种具有广泛应用前景的抗癌药物之一。

肿瘤细胞的恶性增殖是肿瘤发展的重要因素之一。张淑琴等[15]比较了淫羊藿素抑制人肾癌细胞786-O、人肺癌细胞A549及人肝癌细胞HepG2共3种肿瘤细胞增殖的效果，发现其对上述3种肿瘤细胞的增殖均有明显抑制作用。本研究通过MTT实验发现，使用淫羊藿素可以有效抑制肝癌细胞的增殖，且随着使用浓度的升高其抑制效果显著增强，这与张淑琴等[15]的研究结论类似。使用淫羊藿素对肝癌细胞的半数致死浓度(IC50)为5.38 μM/L。本实验选取0、0.5、5、10 μM/L四个浓度用于后续对HepG2细胞增殖、凋亡表达影响的探讨。通过克隆形成实验发现，与空白对照组比较，当使用不同浓度的淫羊藿素溶液处理HepG2细胞时，细胞克隆形成率出现明显下降，且克隆形成率随淫羊藿素溶液的增大而下降，提示淫羊藿素对于HepG2细胞的增殖能力具有良好的抑制作用，这与本研究中此前的MTT实验结果所对应。同时，本研究进一步通过Western blot实验检测了增殖相关蛋白Ki-67的表达水平。Ki-67是常见的调控细胞增殖的蛋白之一，既往文献显示，其表达水平与增殖能力呈正相关[16]。本研究发现，与空白对照组相比，使用淫羊藿素处理后肝癌细胞的增殖受到了显著抑制，说明淫羊藿素可以抑制肝癌细胞的增殖。黄佳彬[17]研究表明，淫羊藿素能够通过调控有丝分裂的相关蛋白使肝癌Hep G2细胞S期被阻滞，这可能是淫羊藿素抑制细胞增殖的机制之一。

本研究通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，与空白对照组比较，当使用淫羊藿素溶液处理HepG2细胞时，细胞凋亡率显著增高，提示淫羊藿素可诱导HepG2细胞发生凋亡。细胞凋亡是其重要的生物学特征，这种生物学特征收到相关蛋白的调控目前研究较多的包括Bcl-2家族和Caspase家族[18-19]。李晶等[20]研究表明，淫羊藿素可以调控活化型肝星状细胞系HSC-T6(大鼠)中Bax及Caspase-3的表达，调控HSC-T6细胞的凋亡。本研究在人肝癌HepG2细胞中发现了类似的结论，相比空白对照组，使用淫羊藿素处理后的各组肝癌细胞Bax、Caspase-3蛋白相对表达水平显著升高，Bcl-2蛋白相对表达水平显著降低。这说明淫羊藿素可以有效抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并促进凋亡蛋白Bax的表达，激活Caspase家族的凋亡启动子Caspase-3，从而促进人肝癌HepG2细胞的凋亡。

4 结论

淫羊藿素可以抑制肝癌Hep-G2细胞增殖并促进其凋亡，其作用机制可能与下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白的表达以及增强caspase-3的活性相关。