结核感染T细胞斑点试验联合胸腔积液腺苷脱氨酶检测对胸腔积液患者中活动性肺结核病的早期诊断及疗效评估价值

曹雯雯，刘 欣，杨 阳

结核病是一种慢性传染性疾病，是由结核分枝杆菌感染引起，致死率较高。据世界卫生组织报道，每年有1 000万结核病新发病例，且近年来发病率持续上升[1]。我国是结核病高发区，发病人数在世界范围内排名靠前，严重威胁人类生命健康安全。临床上可将结核病分为活动性结核和潜伏性结核[2]。活动性肺结核初期患者主要有发热、咯痰等症状，临床特征并不明显，容易导致误诊。当出现咳嗽、咯血等特征时患者已进入中晚期，如无法及时诊断肺结核，可能会延误结核病的最佳治疗时机。因此，如何早期发现潜在的活动性肺结核患者是结核病防治的重点[3]。结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）是以T细胞免疫应答作为基础的γ干扰素释放试验，用于结核分枝杆菌的检测和结核病的辅助诊断[4]。胸腔积液生化指标检测对肺结核患者的明确诊断具有至关重要的作用，其腺苷脱氨酶（ADA）作为鉴别结核性与恶性胸腔积液重要指标之一，是目前性价比较高的诊断手段[5]。单一指标诊断活动性肺结核的准确度较低，且存在标本污染等问题，因此，寻找灵敏度、特异度、准确度较高的生物学标志物对活动性结核的诊断具有重要临床价值。蒋鹏[6]研究发现联合检测ADA和乳酸脱氢酶（LDH）对结核性胸腔积液具有较高诊断价值，本研究拟探讨T-SPOT.TB联合胸腔积液ADA检测对活动性肺结核患者的诊断价值，以期寻找契合度和准确度高的诊断 方案。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2016年1月—2018年6月在山东第一医科大学第二附属医院（原泰山医学院附属医院）就诊的有肺部病灶伴胸腔积液患者201例，患者年龄在30～70岁，平均（46.5±8.7）岁，其中男136例，女65例。患者入院后均经超声、计算机断层摄影（CT）检查证实存在胸腔积液。所有患者均经影像学检查、痰结核分枝杆菌DNA、痰涂片检查进行诊断，根据诊断结果将患者分为活动性肺结核组（76例）和非结核组（125例）。本研究经医学伦理委员会审核批准，入选人员对研究内容完全了解，所有患者及其家属均签署知情同意书。

1.2 活动性肺结核诊断标准[7]

①X线检查肺部有空洞、增殖性病变、渗出性病变、干酪性病变；②病原菌阳性患者，正在治疗且未完成规定疗程的患者；③病原菌阴性患者，抗结核治疗＜3个月，或病原菌阳性患者，中断治疗＜2个月，初治者治疗＜5个月，复治者治疗＜6个月。此次痰结核菌检查阴性，且符合上述情况之一者为活动性肺结核。

1.3 研究方法

外周血T-SPOT.TB检测：检测工具采用酶联免疫斑点的配套仪器，于患者入院后第2天清晨，无需空腹，采取6～8 mL外周全血，用肝素钠抗凝处理，保存于18～25℃，24 h内采用T-SPOT.TB试剂盒（英国Oxford Immunotec公司）完成检测。TB-Ab检测：应用免疫金标本技术检测血清中结核分枝杆菌IgG抗体。结核菌素（PPD）试验：取0.1 mL结核菌素稀释液，于患者左前臂掌侧中下部1/3交界处予以皮内注射，形成6～10 mm大小的皮丘；2～3 d后测量形成的硬结直径，判断诊断结果。试验前需向患者说明试验原理并征求其同意。

取每例患者治疗前首次获得的胸腔积液60 mL，其中将10 mL胸腔积液分别置于2个肝素抗凝管中，采用全自动生化分析仪（美国Beckman公司）检测其总蛋白水平；LDH、ADA试剂盒（美国罗氏公司）分别检测其LDH、ADA水平；另外50 mL胸腔积液中加入0.2 mL的2 500 U肝素抗凝，采用T-SPOT.TB试剂盒检测T-SPOT.TB水平。严格按照试剂盒说明书步骤检测。

T-SPOT.TB检测步骤：①胸腔积液T-SPOT.TB的检测，胸腔积液经700×g离心7 min后去除上清液，RPMI 1640细胞培养液重悬沉淀物，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞；按照说明书，每个患者样本设置4个检测孔，在包被有小鼠抗人γ干扰素单抗的微孔培养板的4个检测孔中分别加入细胞培养液（阴性对照孔）、早期分泌靶向抗原6（抗原A）、培养滤过蛋白10（抗原B）和植物血凝素（阳性对照孔）；将制备的单个核细胞分别加入到上述4孔中，加细胞终止液孵育16～20 h；弃去细胞液，PBS洗涤，加经PBS稀释的酶标抗体工作液孵育1 h，弃去酶标抗体工作液，加底物显色溶液显色；去离子水洗涤培养板终止反应，晾干后采用酶联斑点分析仪观察每孔斑点数（细胞数）。②外周血T-SPOT.TB的检测，外周血置于肝素钠抗凝管中混匀后与RPMI 1640细胞培养液1∶1混匀，加在Ficoll淋巴细胞分离液上层，离心分离出单个核细胞，后续操作步骤同胸腔积液T-SPOT.TB的检测。阳性结果判定[8]：检测孔斑点数－阴性对照孔斑点数（0～5个）≥6为阳性；检测孔斑点数＞2×阴性对照孔斑点数（≥6个）为阳性；实验结果中阳性质控均正常（阳性对照孔斑点数≥20个）；不符合上述阳性标准且阳性质控正常时为阴性。

1.4 统计学分析

数据分析采用SPSS 25.0软件，偏态分布的计量资料采用中位数（范围）表示。 以频数形式表示计量资料，组间比较采用χ2检验，Pearson相关性方法分析T-SPOT.TB及胸腔积液ADA相关生化指标间的相关性，P＜0.05表示差异有统计学意义。结合临床，将单因素分析差异有统计学意义 （P＜0.05）的变量纳入多因素logistic回归模型，以建立预测模型。将多因素分析中P＜0.001的独立危险因素纳入疗效评估模型。将胸腔积液总蛋白＞30.91 g/L、胸腔积液ADA＞31.65 U/L、PPD试验阴性、TB-Ab检测阴性、T-SPOT.TB阳性、肝功能不全、结核接触史的患者各予以赋1分，得分＞5为高风险组，＞2～5分为中风险组，≤2分为低风险组。最终分值越高，则风险越高[9]。受试者工作特征（ROC）曲线分析模型对活动性肺结核患者的预测价值，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料比较

两组患者一般临床资料比较显示：对比活动性肺结核组和非结核组性别、年龄、BMI等基本资料差异均无统计学意义（P＞0.05），说明分组在后续的指标中具有可比性。两组患者球蛋白、肌酐、吸烟史、糖尿病史、总胆红素、细菌感染、支气管扩张、哮喘、实体瘤和血管炎比较差异无统计学意义（P＞0.05）。两组患者结核接触史、乙型肝炎、肝功能不全和结节性红斑相比，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 两组患者一般临床资料比较Table 1 Patient characteristics compared between patients with active tuberculosis and those without tuberculosis

2.2 两组患者T-SPOT.TB和胸腔积液ADA相关生化指标的比较

活动性肺结核组胸腔积液总蛋白、胸腔积液ADA和胸腔积液LDH水平均高于非结核组，且两组患者在TB-Ab检测阴性、外周血T-SPOT.TB阳性、胸腔积液T-SPOT.TB阳性、胸腔积液总蛋白、胸腔积液ADA（P＜0.01），PPD试验阴性和胸腔积液LDH（P＜0.05）中比较差异均有统计学意义。见表2。

表2 T-SPOT.TB和胸腔积液ADA相关生化指标的相关性分析Table 2 Correlation analysis between tuberculosis assays and relevant biomarkers and T-SPOT.TB test in pleural effusion

2.3 影响因素分析

根据本院201例患者的一般资料进行多因素分析，将单因素分析差异有统计学意义的变量纳入分析，发生活动性肺结核为因变量，建立预测模型。结果发现胸腔积液总蛋白、胸腔积液ADA、PPD试验阴性、TB-Ab检测阴性、外周血T-SPOT.TB阳性、胸腔积液T-SPOT.TB阳性、肝功能不全、结核接触史为活动性肺结核发生的独立危险因素。见图1。

2.4 相关性分析

Pearson相关分析显示，PPD试验阴性、TB-Ab检测阴性、外周血T-SPOT.TB阳性分别与生化指标胸腔积液总蛋白、胸腔积液ADA、胸腔积液T-SPOT.TB呈正相关（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 诊断价值

ROC曲线分析表明：胸腔积液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB和胸腔积液ADA最佳临界值分别为276.43×106/mL、39.68×106/mL和45.36 U/L，ROC曲线AUC分别为0.712、0.698和0.669，且灵敏度分别为75.31%、72.93%和67.12%，特异度分别为73.64%、71.62%和62.09%，具有诊断价值。胸腔积液T-SPOT.TB、ADA联合预测活动性肺结核病与外周血T-SPOT.TB、胸腔积液ADA联合预测时AUC分别为0.826与0.811 （P＜0.001），灵敏度分别为83.49%与80.62%，特异度分别为70.36%与67.24%，均较三者单独预测时明显增加（P＜0.05），说明联合诊断价值更高。见图2。

2.6 建立活动性肺结核风险评估模型

将独立危险因素纳入构建中高危活动性肺结核患者风险评分模型，得分＞5为高风险组，＞2～5分为中风险组，≤2分为低风险组。见图3。

2.7 分析模型效能

疗效评估模型的评价：ROC曲线显示，曲线AUC=0.837，95%CI：0.751～0.897，诊断灵敏度和特异度分别为84.00%和69.37%，结果提示该评估模型对活动性肺结核患者具有较好的预测价值，见图4。

3 讨论

结核病是一种慢性传染病，全世界每年估计有近180万与结核病相关患者死亡[10]。从全球结核病疫情控制情况来看，中国是主要的结核病高负担国家。我国活动性肺结核患者每年死亡人数约5万，且近年发病率持续增高[11]。结核病可累及全身各个系统，临床表现多样且不典型，在临床上的诊断较为困难，误诊率较高。我国是结核病高发区，如何对患者进行及早有效的诊断是目前临床上亟待解决的问题。痰培养、影像学检查、PPD试验及临床表现是当前临床上综合判断结核病的方法，但PPD试验及痰培养在常规接种卡介苗国家的诊断特异度和灵敏度较低[12]。影像学检查和临床表现是诊断结核病的辅助手段，但无法确诊，因此寻找早期诊断活动性肺结核的快速、准确方法至关重要。目前诊断方法较多，但每种诊断方法均有不一样的特异度和灵敏度。T-SPOT.TB、PPD试验、胸腔积液ADA等均是临床常用于检测结核病的方法[13-15]。据此，本研究探讨联合T-SPOT.TB和胸腔积液ADA对活动性肺结核患者的诊断价值，为临床上早期发现、早期诊断及疗效评估提供更客观科学的依据。

T-SPOT.TB是近年来兴起的检测结核分枝杆菌感染的新技术，对结核感染诊断具有较高的灵敏度和特异度。张群[16]研究发现T-SPOT.TB在不同人群中的灵敏度和特异度波动较大，若将其作为诊断结核病的排除性标准，会导致T-SPOT.TB低敏感性人群的结核病漏诊率大大增加；有研究表明活动性肺结核患者胸腔积液ADA水平高于非结核患者，ADA的测定是目前性价比较高的诊断手段[17]，所以考虑两者联合提高患者诊断率。本研究回顾性分析患者临床资料，发现活动性肺结核组和非结核组性别、年龄、BMI、球蛋白、肌酐、吸烟史、糖尿病史、总胆红素、细菌感染、支气管扩张、哮喘、实体瘤和血管炎等比较差异无统计学意义，结核接触史、乙型肝炎、肝功能不全和结节性红斑的差异有统计学意义。PPD试验是临床上诊断结核分枝杆菌的传统措施，可检测出卡介苗及环境中的分枝杆菌，是通过利用多种抗原混合物进行检测。TB-Ab检测可反映出肺结核患者机体生化及体液免疫方面的改变[15]。胸腔积液是一种常见临床症状，多由胸膜、肺、多种肺外疾病、感染所致，目前临床上已开展的检测项目包括胸腔积液ADA、LDH、肿瘤标志物癌胚抗原和总蛋白等检测，有助于结核病的鉴别和诊断[6]。 本研究中活动性肺结核组患者胸腔积液总蛋白、ADA和LDH水平均高于非结核组，且活动性肺结核TB-Ab检测阴性、外周血T-SPOT.TB阳性、胸腔积液T-SPOT.TB阳性、PPD试验阴性患者比例均大于非结核组，与蒋鹏[6]、 景淑贤等[18]研究结果相一致。在此基础上研究T-SPOT.TB与胸腔积液ADA相关生化指标的相关性，发现TB-Ab检测阴性、PPD试验阴性、T-SPOT.TB阳性分别与胸腔积液总蛋白、胸腔积液ADA、胸腔积液T-SPOT.TB呈正相关。ROC曲线分析验证了胸腔积液T-SPOT.TB联合胸腔积液ADA、外周血T-SPOT.TB联合胸腔积液ADA的AUC分别为0.826、0.811，均较胸腔积液T-SPOT.TB、ADA、外周血T-SPOT.TB单独预测的AUC明显增加，提示联合具有更高的诊断价值。

诸多研究表明年龄、结核接触史、吸烟史等是导致活动性肺结核发生的危险因素[19-20]。本研究将单因素分析差异有统计学意义的变量纳入分析，结果发现胸腔积液总蛋白、胸腔积液ADA、PPD试验阴性、TB-Ab检测阴性、外周血T-SPOT.TB阳性、胸腔积液T-SPOT.TB阳性、肝功能不全、结核接触史为活动性肺结核发生的独立危险因素。近年来，用于预测肺结核疗效的评分系统、灰色预测模型、BP神经网络模型等应用逐渐广泛[21]。 但在活动性肺结核患者中仍缺乏一个良好的疗效评估模型，本研究结合logistic多因素分析的独立危险因素构建疗效评估模型，ROC曲线结果表明AUC=0.837，95%CI：0.751～0.897，诊断灵敏度为84.00%，特异度为69.37%，说明该模型具有较好的效能和一致性的预测价值。

综上所述，T-SPOT.TB联合胸腔积液ADA对活动性肺结核患者具有较好的诊断及鉴别诊断价值，构建基于T-SPOT.TB联合胸腔积液ADA与其他危险因素的疗效评估模型，可提高有效预测患者发生活动性肺结核水平，协助临床医师对活动性肺结核患者采取有效的治疗决策。