miR-107对卵巢癌细胞免疫逃逸的调控和紫杉醇耐药性的影响

王青慧,李 波,胡传翠,聂明朝,郑小妹

（1.海南省妇女儿童医学中心妇产科，海南 海口 570206；2.海南医学院第一附属医院妇产科，海南 海口 570102）

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，在世界范围内卵巢癌发病率越来越高，且大多数患者处于肿瘤晚期［1］。仅2018年就有15 000例美国患者和22 000例中国患者死于卵巢癌。尽管采用了化疗药物的治疗，但大多数OC患者出现化疗耐药导致治疗效果不理想［2］。紫杉醇（taxol，TAX）是一种卵巢癌治疗过程中长期临床应用的一线化疗药物之一，TAX的耐药性是卵巢癌患者治疗失败的主要原因［3］。肿瘤免疫逃逸是指肿瘤细胞通过不同机制逃避免疫系统的识别和攻击而异常增殖的现象，这是肿瘤细胞生存和发展的重要策略，也被证明是卵巢癌患者治疗的主要障碍之一［4］。淋巴细胞是机体免疫应答的重要组成部分，参与调控肿瘤细胞的免疫逃逸。因此，了解化疗耐药和免疫逃逸的潜在机制及识别其预后、诊断治疗意义的新靶点至关重要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是短链非编码RNA，通过直接与mRNA靶标的3′UTR结合，导致mRNA降解或翻译抑制。miRNA在多种类型的癌症中发挥重要作用，包括调节癌细胞分化、增殖、转移和耐药性，参与肿瘤进展［5］。近年来，miR-107在乳腺癌［6］、肝细胞癌［7］和膀胱癌［8］等多种癌症中被广泛研究。TANG等［9］报道：miR-107在卵巢癌患者和卵巢癌细胞中呈低表达；但miR-107对卵巢癌细胞免疫逃逸调控和耐药性的影响仍有待研究。本研究探讨miR-107对卵巢癌细胞免疫逃逸及其对TAX耐药的影响，为卵巢癌的临床诊断和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人卵巢上皮细胞HOSEpic购自广东省深圳市豪地华拓生物科技有限公司，人卵巢癌A 2780、OVCAR4、OVCAR5、SKOV 3和Caov-3细胞、DMEM细胞培养基、RPMI-1640细胞培养基及胎牛血清均购自南京科佰生物科技有限公司。人外周血淋巴细胞HPBL购自武汉普诺赛生命科技有限公司，TAX（纯度99%）购自上海麦克林生化科技有限公司，MAP3K7、Fas和Actin抗体购自英国Abcam公司，CCK-8试剂盒和AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司，蛋白检测试剂盒和ECL化学发光底物购自美国Thermo Fisher公司，pcDNA质粒购自上海研酶生物科技有限公司，Qiagen一步式实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒购自上海宾智生物科技有限公司。RT-qPCR仪CFX96购自美国Bio-Rad公司，BD FACSAria™Fusion流式细胞仪购自美国BD Biosciences公司，Synergy H 1M全功能酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2 细胞培养和TAX耐药细胞的构建HOSEpic和HPBL细胞培养在含10%FBS和1%双抗的RPMI-1640培养基中，卵巢癌A 2780、OVCAR4、OVCAR5和SKOV 3细胞置于含10%FBS的RPMI-1640培养基中，Caov-3细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基中；培养基置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。取生长良好的SKOV 3细胞，将细胞置于0.01μmol·L－1TAX中培养24 h，观察细胞生长状况，若生长良好则更换新鲜的培养基，继续增加TAX浓度，直至细胞可以稳定存活在终浓度为0.3μmol·L－1TAX中，即成功构建SKOV 3的TAX耐药细胞SKOV 3/TAX。

1.3 细胞转染取对数生长期的SKOV 3/TAX细胞，根据试剂盒转染说明书，将miR-107 mimics、pcDNA-MAP3K 7和 miR-107 mimics+pcDNAMAP3K 7分别转染至SKOV 3/TAX细胞中，置于37℃的细胞培养箱中培养48 h，采用RT-qPCR或Western blotting法检测细胞转染情况。如转染后细胞中MAP3K 7 mRNA和蛋白表达水平明显高于未转染的细胞，则视为细胞转染成功。

1.4 SKOV 3/TAX细胞与HPBL细胞共培养和细胞分组转染成功后，分别将转染miR-107 mimics和miR-107 mimics+pcDNA-MAP3K7且经4μmol·L－1处理的SKOV 3/TAX细胞和HPBL细胞在37℃、5%CO2条件下共培养24 h。293T、SKOV 3/TAX和HPBL细胞分组：293T细胞分为miR-NC组（转染miR-NC）和miR-107 mimics组（转染miR-107 mimics）；SKOV 3/TAX细胞分为空白对照组、TAX（给予4.0μmol·L－1TAX）组、TAX+miR-107 mimics（给予4.0μmol·L－1TAX且转染miR-107 mimics） 组和 TAX+miR-107 mimics+pcDNA-MAP3K 7（给予4.0μmol·L－1TAX且转染miR-107 mimics和pcDNA-MAP3K 7）组；HPBL细胞分为HPBL组、HPBL+SKOV 3/TAX（HPBL与SKOV 3/TAX细胞共培养）组、HPBL+SKOV 3/TAX+TAX（HPBL与4.0μmol·L－1TAX处理的SKOV 3/TAX细胞共培养）组、HPBL+SKOV 3/TAX+TAX+miR-107 mimics（HPBL与4.0μmol·L－1TAX处理且转染miR-107 mimics的SKOV 3/TAX细胞共培养）组和HPBL+SKOV 3/TAX+TAX+miR-107 mimics+pcDNA-MAP3K7（HPBL与4.0μmol·L－1TAX处理且转染miR-107 mimics和pcDNA-MAP3K 7的SKOV 3/TAX细胞共培养）组。

1.5 RT-qPCR法检测各组细胞中miR-107表达水平采用TRIzol试剂从各组细胞中分离出总RNA，采用Qiagen一步式RT-qPCR试剂盒将每个样品1μg总RNA合成cDNA。根据实时定量PCR试剂盒说明书，将cDNA、SYBR-Green Mix和引物混合，进行RT-qPCR反应。以U6作为内参，采用2－ΔΔCt法计算各组细胞中miR-107表达水平。引物序列：miR-107上游引物5′-GCCGAATTCAAAGCGAGATTCCATCAGCA-3′，miR-107下 游 引 物5′-GCCGGATCCTGTCAACCCAGAACTCAAAGG-3′；U 6上 游 引 物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U 6下 游 引 物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2－ΔΔCt法计算各组细胞中miR-107表达水平。

1.6 双荧光素酶报告基因实验验证miR-107和MAP3K 7的靶向关系采用PCR扩增MAP3K 7与miR-107结合序列的3′-UTR，同时突变MAP3K7序列，获得突变型MAP3K7。将MAP3K7-WT和MAP3K 7-MUT分别插入含萤火虫荧光素酶报告基因的pGL 4载体中。按照每孔5×105个细胞的密度，将HEK293细胞置于24孔板中。将100 ng pGL 4-MAP3K7-WT 或 pGL 4-MAP3K7-MUT、100 nmol·L－1的miR-107 mimics（miR-107 mimics组）或阴性对照（miR-NC组）及脂质体共转染入HEK293细胞。培养细胞48 h后，采用双荧光素酶分析系统计算荧光素酶活性。海肾荧光素酶活性作为内参。荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。

1.7 Western blotting法检测各组细胞中MAP3K 7和FAS蛋白表达水平采用RIPA裂解缓冲液在4℃下裂解细胞中总蛋白，并以12 000 r·min－1离心。采用BCA蛋白检测试剂盒检测收集的上清液中蛋白浓度。采用10%SDS-PAGE分离总蛋白。SDS-PAGE后分离的蛋白被转移至PVDF膜上，并封闭于5%无脂牛奶稀释的TBST缓冲液中。采用抗MAP3K7（1∶2 000）、β-actin（1∶2 000）的主要抗体在4℃孵育过夜。第2天，将膜与相应二抗（1∶1 000）孵育2 h。ECL底物增强蛋白印迹信号，以β-actin作为内参，采用Image J软体分析条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参β-actin条带灰度值。

1.8 CCK-8法检测各组细胞存活率将SKOV 3/TAX细胞以每孔2 000个的密度接种于96孔板中。分别向每孔中添加0、1、2、3、4和5μmol·L－1TAX，在37℃、5%CO2环境中培养48 h。每孔加入10μL CCK-8溶液混匀静置30 min，采用酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值，并计算半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）。

1.9 流式细胞术检测各组细胞凋亡率将转染后的各组SKOV 3/TAX细胞及与SKOV 3/TAX细胞共培养的HPBL细胞按每板3×105个细胞的密度接种于24孔板中。培养24 h后，收集细胞，采用PBS冲洗，并重新悬浮于0.5 mL结合缓冲液中。然后将细胞与AnnexinⅤ-FITC和PI染液按1∶2的体积比避光孵育20 min。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。细胞凋亡率=（凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.10 统计学分析采用GraphPad Prism 7.0统计软件进行统计学分析并绘制图表。各组细胞中miR-107表达水平，细胞中MAP3K7和FAS蛋白表达水平，细胞存活率及细胞凋亡率均符合正态分布，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNKq检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞中miR-107表达水平与人卵巢上皮细胞HOSEpic（1.01±0.09）比较，人卵巢癌细 胞A 2780（0.62±0.10）、OVCAR4（0.80±0.05）、 OVCAR5（0.64±0.14） 和 SKOV 3（0.35±0.07）中miR-107表 达 水 平 降 低（P＜0.01）；SKOV 3细胞中miR-107表达水平低于其他细胞（P＜0.05），且TAX耐药细胞SKOV 3/TAX细胞中miR-107表达水平（0.21±0.05）低于SKOV 3细胞（P＜0.05）。

2.2 miR-107与MAP3K7的靶向关系StarBase数据库预测发现：MAP3K 7的3′-UTR与miR-107存在靶向结合位点（图1）。双荧光素酶报告基因实验表明：与miR-NC组比较，过表达miR-107组野生型MAP3K7的荧光素酶活性降低（P＜0.01），见图2。Western blotting检测结果显示：过表达miR-107组细胞中MAP3K7蛋白表达水平（0.34±0.11）明显低于miR-NC组（1.02±0.11）（P＜0.01）。见图3。

图1 Star Base数据库预测miR-107和MAP3K 7的靶向结合位点Fig.1 Targeted binding sites of miR-107 and MAP3K7 predicted by Star Base database

图2 双荧光素酶报告基因实验检测2组野生型和突变型MAP3K 7的荧光素酶活性Fig.2 Luciferase activities of wild-type and mutationtype of MAP3K 7 in two groups detected by dual luciferase reporter gene assay

图3 Western blotting法检测2组细胞中MAP3K 7蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of MAP3K7 protein in cells in two groups detected by Western blotting method

2.3 过表达miR-107后各组SKOV 3/TAX细胞存活率和细胞中miR-107表达水平0、1、2、3、4和5μmol·L－1TAX处理SKOV 3/TAX细胞后，CCK-8法检测各组SKOV 3/TAX细胞存活率结果显示：随着TAX浓度的增加，SKOV 3/TAX细胞存活 率 降 低（P＜0.05），且IC50为（4.21±0.37）μmol·L－1，故将4.0μmol·L－1TAX作为药物处理浓度，见表1。RT-qPCR检测结果显示：与空白对照组比较，TAX组SKOV 3/TAX细胞中miR-107表 达 水 平 升 高（P＜0.01），miR-107 mimics+TAX组SKOV 3/TAX细胞中miR-107表达水平较TAX组升高（P＜0.05），说明miR-107 mimics转染成功。见表2。

表1 各组SKOV 3/TAX细胞存活率Tab.1 Survival rate of SKOV 3/TAX cells in various groups(n=3，±s，η/%）

表1 各组SKOV 3/TAX细胞存活率Tab.1 Survival rate of SKOV 3/TAX cells in various groups(n=3，±s，η/%）

表2 各组SKOV 3/TAX细胞中miR-107表达水平Tab.2 Expression levels of miR-107 in SKOV 3/TAX cells in various groups

2.4 各组SKOV 3/TAX细胞中MAP3K 3和FAS蛋白表达水平与空白对照组比较，TAX组SKOV 3/TAX细胞中MAP3K7和FAS蛋白表达水平降低（P＜0.01）；与TAX组比较，TAX+miR-107 mimics SKOV 3/TAX细胞中MAP3K7和FAS蛋白表达水平降低（P＜0.05或P＜0.01）；与TAX+miR-107 mimics组比较，TAX+miR-107 mimics+pcDNA-MAP3K7组SKOV 3/TAX细胞中MAP3K 7和FAS蛋白表达水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。见图4和表3。

表3 各组SKOV 3/TAX细胞中MAP3K 7和FAS蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of MAP3K7 and FAS proteins in SKOV 3/TAX cells in various groups (n=3，±s）

表3 各组SKOV 3/TAX细胞中MAP3K 7和FAS蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of MAP3K7 and FAS proteins in SKOV 3/TAX cells in various groups (n=3，±s）

**P＜0.01 compared with blank control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with TAX group；#P＜0.05 compared with TAX+miR-107 mimics group.

Group Expression level of FAS Expression level of MAP3K7 1.01±0.12 0.56±0.10*0.25±0.07△0.68±0.05#1.00±0.07 0.74±0.08*0.30±0.06△△0.59±0.10#Blank control TAX TAX+miR-107 mimics TAX+miR-107 mimics+pcDNA-MAP3K 7

图4 Western blotting法检测各组SKOV 3/TAX细胞中MAP3K 7和FAS蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoregram of expressions of MAP3K 7 and FAS proteins in SKOV 3/TAX cells in various groups detected by Western blotting method

2.5 各组HPBL细胞中FAS蛋白表达水平和细胞凋亡率采用Western blotting和流式细胞术检测结果显示：与HPBL+SKOV 3/TAX组比较，HPBL+SKOV 3/TAX+TAX组HPBL细胞中FAS蛋白表达水平降低（P＜0.05），细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与HPBL+SKOV 3/TAX+TAX组比较，HPBL+SKOV 3/TAX+TAX+miR-107 mimics组HPBL细胞中FAS蛋白表达水平和细胞凋亡率降低 （P＜0.05）；与 HPBL+SKOV 3/TAX+TAX+miR-107 mimics组比较，HPBL+SKOV 3/TAX+TAX+miR-107 mimics+pcDNA-MAP3K7组HPBL细胞中FAS蛋白表达水平和细胞凋亡率降低（P＜0.01）。见图5、图6和表4。

表4 各组HPBL细胞中FAS蛋白表达水平和HPBL细胞凋亡率Tab.4 Expression level of FAS protein of HPBL cells and apoptotic rates of HPBL cells in various groups (n=3，±s）

表4 各组HPBL细胞中FAS蛋白表达水平和HPBL细胞凋亡率Tab.4 Expression level of FAS protein of HPBL cells and apoptotic rates of HPBL cells in various groups (n=3，±s）

*P＜0.01 compared with HPBL group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with HPBL+SKOV 3/T AX group；#P＜0.05 compared with HPBL+SKOV 3/TAX+TAX group；○P＜0.05 compared with HPBL+SKOV 3/TAX+TAX+miR-107 mimics group.

图5 Western blotting法检测各组HPBL细胞中FAS蛋白表达电泳图Fig.5 Electrophoregram of expressions FAS protein in HPBL cells in various groups detected by Western blotting method

图6 流式细胞术检测各组HPBL细胞凋亡率Fig.6 Apoptotic rates of HPBL cells in various groups detected by flow cytometry

2.6 各组SKOV 3/TAX细胞存活率和细胞凋亡率与空白对照组比较，TAX组SKOV 3/TAX细胞存活率降低（P＜0.05）；TAX+miR-107 mimics组SKOV 3/TAX细胞存活率明显低于TAX组（P＜0.05）。与TAX+miR-107 mimics组 比 较，TAX+miR-107mimics+pcDNA-MAP3K 7 组SKOV 3/TAX细胞存活率明显升高（P＜0.05）。流式细胞术检测结果显示：TAX组SKOV 3/TAX细胞凋亡率高于空白对照组（P＜0.05），TAX+miR-107组SKOV 3/TAX细胞凋亡率较TAX组明显 升 高（P＜0.05），TAX+miR-107 mimics+pcDNA-MAP3K7组细胞凋亡率明显低于TAX+miR-107 mimics组（P＜0.05）。见图7和表5。

表5 各组SKOV 3/TAX细胞存活率和细胞凋亡率Tab.5 Survivals rates and apoptotic rates of SKOV 3/TAX cells in various groups (n=3，±s，η/%）

表5 各组SKOV 3/TAX细胞存活率和细胞凋亡率Tab.5 Survivals rates and apoptotic rates of SKOV 3/TAX cells in various groups (n=3，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with TAX group；#P＜0.05 compared with TAX+miR-107 mimics group.

Apoptotic rate 11.01±2.17 17.43±1.68**26.42±3.03△20.51±0.95#Group Blank control TAX TAX+miR-107 mimics TAX+miR-107 mimics+pc DNA-MAP3K 7 Survival rate 1.95±0.22 1.56±0.08*1.07±0.17△1.47±0.12#

图7 流式细胞术检测各组SKOV 3/TAX细胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of SKOV 3/TAX cells in various groups detected by flow cytometry

3 讨 论

卵巢癌是妇科肿瘤死亡的最常见原因，只有不到40%的女性在确诊后存活5年以上，这主要是由于复发性化学耐药疾病的发展，一旦复发，尚不能有效治疗患者［10］。TAX是治疗卵巢癌的一线化疗药物之一，化疗耐药是其临床治疗成功的主要限制因素［3］，迫切需要找到与化疗抗性和疾病复发相关的治疗靶标。肿瘤免疫治疗是一种有前途的治疗方法，其特点是激活免疫系统诱导肿瘤免疫监视或逆转肿瘤的免疫逃逸。FAS作为肿瘤坏死因子家族的主要成员，在细胞凋亡中起重要作用。FASL是FAS的天然配体，FAS/FASL结合是凋亡信号的传导途径，在淋巴细胞中可通过该途径杀伤表达FAS的靶细胞［11］。研究［12］显示：正常情况下，FAS系统可抑制毒性淋巴细胞的功能和过度激活的免疫反应，当FAS或FASL表达失调时，会出现体内淋巴细胞的过度聚集和自身免疫现象，由此说明FAS系统在集体免疫平衡中具有关键作用。PARDOLL等［13］报道：肿瘤细胞耐药性的产生与癌细胞免疫逃逸密切相关，因此，抑制癌细胞免疫逃逸可能对减少肿瘤耐药性的产生至关重要。

miRNA可通过抑制翻译和其他手段调节基因表达。有研究［14-15］显示：miRNA在肿瘤细胞中的异常表达与癌细胞免疫逃逸和肿瘤耐药性的产生密切相关。例如FUJITA等［16］报道：在肺癌细胞中，miR-197通过CKS1B/STAT 3促进PDL 1的表达，促进肺癌细胞免疫逃逸和顺铂耐药性；NEVIANI等［17］证实：自然杀伤细胞来源的外泌体miR-186可抑制神经母细胞瘤的生长和免疫逃逸机制。近年来，miR-107在乳腺癌［18］、胃癌［19］和胰腺癌［20］等多种癌症的发展进程中发挥重要作用，可能参与肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭和转移等生物学行为的调控。在结肠癌中，过表达miR-107靶向下调TFR1，抑制癌细胞的增殖和转移［21］；miR-107在非小细胞肺癌细胞中表达下调，通过抑制STK33/ERK信号通路的激活，抑制非小细胞肺癌的恶行生物学行为［22］。本研究结果显示：miR-107在SKOV 3/TAX细胞中表达降低，这与TANG等［23］的报道一致。此外，本研究结果证实：过表达miR-107可抑制HPBL细胞免疫逃逸，抑制SKOV 3/TAX细胞增殖并诱导细胞凋亡，缓解卵巢癌患者HPBL细胞对TAX耐药性。

MAP3K7是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其调节多种细胞信号通路，是许多与癌细胞生长相关细胞通路的重要调控因子［24］。例如过表达miR-143靶向下调MAP3K7的表达，抑制乳腺癌细胞生长［25］；MAP3K 7在胃癌细胞中高表达，可促进胃癌细胞的 异 常 增 殖［26］。ZEHEVI等［27］研 究 显 示：MAP3K 7在黑色素瘤中表达升高，miR-377通过靶向下调MAP3K7，阻断NF-κB信号通路的激活，抑制黑色素瘤的生长和转移。JIN等［28］研究显示：MAP3K7参与调控肿瘤的免疫作用。本研究结果证实：MAP3K7是miR-107的靶基因，过表达miR-107可抑制与SKOV 3/TAX细胞共培养的HPBL细胞中FAS的表达和细胞凋亡，抑制SKOV 3/TAX细胞的增殖并诱导细胞凋亡。过表达MAP3K7可逆转过表达miR-107对HPBL细胞中FAS的表达和细胞凋亡及对SKOV 3/TAX细胞增殖和凋亡的作用。

综上所述，miR-107低表达与卵巢癌细胞TAX耐药性有关联，过表达miR-107通过靶向下调MAP3K 7的表达，抑制SKOV 3/TAX细胞免疫逃逸，缓解SKOV 3/TAX细胞对TAX的耐药性。