新型nHA/PLGA纳米复合微球对大鼠颅骨缺损的修复作用

潘 洁,汪德州,宋文植

（1.长春医学高等专科学校口腔教研室，吉林 长春 130031；2.吉林大学中日联谊医院口腔科，吉林 长春 130021）

在口腔临床工作中，常因为肿瘤、外伤和感染等原因造成口腔颌面部的骨质缺损，而充足的骨量有利于提高口腔各类修复的稳定性和长期保存率；如口腔种植术过程中，为了确保种植体的成活率，口腔局部必须有足够的骨量支撑［1-3］。目前临床上针对这一情况普遍采取的是牙槽骨骨增量技术，该技术增加了种植术前种植区域的骨量，弥补了骨缺损［4］，在各类牙槽骨增骨材料中，Bio-Oss颗粒具有生物相容性好和可促进血管再生且来源广等优点，在临床中应用广泛，但该材料在生物体内降解缓慢，有研究［5］显示：Bio-OSS颗粒需要长达3～5年才能完全降解，并且价格昂贵，骨粉的异源性可能带来排异反应，因此存在较多争议，故而应寻找到一些既具有良好的生物活性又有较好力学性能的无机化合物或高分子化合物，以丰富骨缺损修复材料的选择［6］。

BOHNER［7］发现：将聚乳酸（polylactic acid，PLA）与聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）聚合而成的聚丙交酯-乙交酯［poly（lactide-co-glycolic acid），PLGA］聚合体，能够通过改变单体之间的比例来控制降解从而得到优异性能，但是纯PLGA材料存在一定缺点，如骨传导性差、机械性能欠佳和缺乏细胞识别等［8］，有学者［9］采用各种方法提升纯PLGA材料的性能，如将PLGA/纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite，n-HA）通过选择性激光烧结的方法制备成三维复合多孔支架，支架结构中加入n-HA，改善了聚合多孔支架的力学性能。GAO等［10］在细胞研究中发现：将骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）同时固定于PLGA/羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）和纯PLGA中，掺入HA能促进细胞骨分化，上述研究或仅局限于体外细胞研究，或所制备的支架体积较大，无法应用于修复口腔颌面骨缺损。颌骨具有特殊的解剖结构，颌骨缺损形态不规则，将微球运用于颌骨缺损逐渐成为一种趋势。因此本实验将无机生物材料nHA与有机高分子材料PLGA混合后，采用气流剪切法制备成形态均一的nHA/PLGA纳米复合微球，置入制备好的大鼠颅骨缺损处，观察nHA/PLGA纳米复合微球对颅骨缺损的修复效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器8周龄SPF级雌性SD大鼠9只，购自吉林大学动物实验中心，动物使用许可证号：SYXK（吉）2016-0001。标准饲料喂养，自由饮水。PLGA（丙交酯/乙交酯=75∶25，相对分子质量为100 000，由中国科学院长春应用化学研究所提供），硝酸钙（北京化学工业集团有限责任公司），青霉素钠（华北制药集团有限责任公司），乙二醇（北京化学工业集团有限责任公司），4%多聚甲醛固定液［阿拉丁试剂（上海）有限公司］，Bio-Oss颗粒［盖思特利商贸（北京）有限公司］。慢速手机（韩国Strong90公司），电子天平（中国上海越平科学仪器制造有限公司），Skyscan1172微计算机断层扫描技术（micro computed tomography，micro-CT）设 备（德国Bruker公司），Discovery CT 750 HD CT（美国GE公司）。

1.2 nHA/PLGA纳米复合微球制备、模型制备和动物分组将硝酸钙溶于含10%乙二醇的水溶液中，通过水热合成法合成nHA纳米粒子，采用70℃烘箱干燥，合成nHA粉体，然后将nHA粉体加入8%PLGA/NMP溶液中，最后通过气流剪切法装置（喷嘴内径30 G、气流强度8 L·min－1）制备出球形度和均一性较好的直径为200～350μm的nHA/PLGA纳米复合微球。选取9只SPF级雌性SD大鼠，禁食、禁水后采用50 mg·kg－1戊巴比妥麻醉，起效后术区备皮固定于手术台上。1%碘伏术区消毒，75%乙醇脱碘，铺孔巾，采用手术刀由额部至颈前做1个矢状切口抵达骨面，钝性分离充分暴露手术区域。慢速手机在生理盐水滴注降温的情况下，沿大鼠颅骨矢状缝对称磨出2个直径为5 mm深达硬膜上的缺损［11］。在9只大鼠颅骨上制备18个骨缺损模型后，随机分为空白组、对照组和实验组，每组6个骨模型，空白组大鼠仅制备颅骨缺损而未填充材料，对照组大鼠于颅骨缺损处植入Bio-Oss颗粒，实验组大鼠于颅骨缺损处植入nHA/PLGA纳米复合微球。黏骨膜瓣复位分层严密缝合，术后肌注20万单位青霉素钠1周抗炎，常规饮食。

1.3 micro-CT检测各组大鼠实验标本缺损区域骨形态学数据严密观察大鼠术区情况，并于全麻下在术后当天、第4周和第8周，对各组大鼠行活体CT检测，观察大鼠术区有无骨质的改变。第8周时采用150 mg·kg－1戊巴比妥麻醉处死大鼠，先将被PBS灌注后的大鼠标本置入4%多聚甲醛溶液中固定备用，采用micro-CT对标本头部损害区域扫描，最后采用三维重建软件对缺损处图像进行处理，检测各组大鼠颅骨缺损区域骨小梁数量（number of trabecular bone，Tb.N）、缺损区域骨小梁间距（trabecular bone spacing，Tb.Sp）、缺损区域骨小梁厚度（trabecular bone thickness，Tb.Th）和缺损区域新生骨量与缺损总体积的比值（new bone volume/total bone volume，BV/TV）。

1.4 统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠颅骨缺损区域Tb.N、缺损区域Tb.Sp、缺损区域Tb.Th和缺损区域BV/TV均符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSDt法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠颅骨缺损面积和新骨形成情况术后当天的CT三维重建结果显示：大鼠颅骨缺损模型与实验设计接近，预备的缺损直径均接近5 mm。在第4周时实验组和对照组大鼠颅骨缺损面积均有所减小，而空白组大鼠颅骨无明显变化。当饲养至第8周时，实验组和对照组大鼠颅骨缺损面积较第4周时均有明显减小，空白组修复效果则不明显。实验组、对照组和空白组大鼠于术后当天、术后4周和术后8周的颅骨CT三维重建见图1。

图1 术后不同时间各组大鼠颅骨CT三维重建图像Fig.1 Images of CT three-dimensional reconstruction of skull of rats in various groups at different time points after surgery

与对照组相似，在饲养至第8周时，实验组大鼠颅骨出现了明显的新骨形成，表明nHA/PLGA纳米复合微球与商品化Bio-Oss颗粒有相似的促成骨能力。

2.2 各组大鼠三维重建后骨缺损处micro-CT图像9只SPF级雌性SD大鼠全部存活，伤口未见排斥反应和感染，故全部实验结果纳入分析。术后8周可见大鼠颅骨手术区域黏膜愈合良好，无化脓和感染等情况发生，沿原手术切口切开翻瓣观察。实验组大鼠颅骨：缺损区域边界清晰，充填材料被纤维结缔组织包绕，颗粒间隙内可见新生骨质；对照组大鼠颅骨：缺损区域见颗粒状骨粉堆积，质地坚硬，无明显吸收，表面被覆纤维结缔组织；空白组大鼠颅骨：缺损区域边界清晰可见少量新骨形成，但缺损中心区域有明显凹陷无明显骨沉积。micro-CT扫描大鼠颅骨标本后，三维软件重建图像见图2。

图2 各组大鼠骨缺损处三维重建后micro-CT图像Fig.2 Micro-CT images of bone defects of rats in various groups after three-dimensional reconstruction

2.3 各组大鼠颅骨标本缺损区域骨形态学数据第8周，与对照组比较，实验组大鼠颅骨缺损区域Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th差异无统计学意义（P＞0.05），BV/TV降低（P＜0.05）；与空白组比较，实验组和对照组大鼠颅骨缺损区域Tb.Sp、Tb.Th和BV/TV差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠缺损区域骨形态学数据Tab.1 Data of bone morphology of defect regions of rats in various groups (n=6，±s）

表1 各组大鼠缺损区域骨形态学数据Tab.1 Data of bone morphology of defect regions of rats in various groups (n=6，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with blank group.

Group Blank Control Experimental Tb.N（mm－1）3.613±0.300 3.890±0.200 3.768±0.200 BV/TV（η/%）28.007±4.820 81.286±4.330△72.034±5.200*△Tb.Sp（l/mm）0.187±0.020 0.058±0.020△0.068±0.020△T b.Th（l/mm）0.078±0.010 0.210±0.010△0.191±0.010△

3 讨 论

对于口腔常规牙列缺损和牙列缺失的患者，目前临床最好的修复方式是种植修复，但部分患者由于各种原因导致局部缺牙区骨量不足，骨质疏松骨密度降低，。而骨密度的高低直接影响种植体的初期稳定性，影响种植手术的成功率［12-14］。充足的骨量也是种植成骨率和长期存活率的保障［15］。

目前临床上对于种植区域骨量不足，主要采用骨替代材料移植填充缺损和骨组织工程这2种方法，其中充填材料效果最佳的是自体骨，是临床的金标准，但是其存在植入后吸收率高（有时高达50%）和二次创伤等缺点［12-16］。自体骨来源有限，同种异体骨来源丰富且能个性化地修复骨缺损［17-18］，但移植后存在排斥反应且有传播疾病的可能性［19］，因此近几年骨组织工程发展迅速，致力于研究出成分、结构和生物特性与天然骨相似的人工材料，以弥补现有材料的不足。

Bio-Oss颗粒是临床上应用最为广泛的骨增量材料，其内部含有大小不一的孔隙，使材料内部表面积增大，并且此材料不含有机成分，亲水能力强，使得缺损区域血液和组织液快速融入材料中，保持植骨区的相对稳定性，有利于新骨的再生和血管的生长［20-22］。研究［23］显示：Bio-Oss颗粒的成骨效果优于其他骨增量材料，可以更早地与缺损区域周围骨组织产生骨融合，但该材料的缺点也同样明显，该材料在生物体内不易吸收且降解缓慢。

本研究将无机生物材料nHA与有机高分子材料PLGA混合后，通过气流剪切法制备成形态均一的nHA/PLGA纳米复合微球，HA是牙槽骨的主要成分，故合成的nHA是最接近天然骨组织的材料。与HA比较，nHA具有更好的生物活性和更强的吸附性［24-25］。PLGA是一种具有很好组织相容性和可降解性的聚合物，是理想的支架和载体材料［26］，在医学领域已被广泛应用。将这2种材料合成nHA/PLGA纳米复合微球，兼顾理想材料的多个特性，如良好的生物相容性、对组织无毒或者毒性低、吸附能力强和降解速率可控等［27］。研究［28］显示：不同浓度的nHA复合微球产生的成骨效果不同，nHA含量为20%的复合微球，能达到最佳修复骨缺损的效果。

本研究结果显示：将20%nHA/PLGA纳米复合微球和Bio-Oss颗粒分别植入大鼠颅骨中，在术后当天、术后4周及术后8周的颅骨CT三维重建中可见：nHA/PLGA纳米复合微球与商品化Bio-Oss颗粒有相似的促成骨能力，术后8周处死大鼠显示大鼠局部皮肤并未出现红肿破溃等排斥反应，填入nHA/PLGA纳米复合微球大鼠颅骨中可见充填材料被纤维结缔组织包绕，颗粒间隙内可见新生骨质，填入Bio-Oss颗粒大鼠颅骨中可见纤维结缔组织包绕着未明显吸收颗粒状骨粉，有新生骨质形成，而这一表现也与XIA等［29］的研究结论具有相似性。术后第8周对大鼠颅骨标本进行micro-CT扫描，三维软件重建图像的结果显示：实验组大鼠颅骨缺损区域Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th与对照组比较差异无统计学意义，但实验组大鼠颅骨缺损区域BV/TV略低于对照组，Bio-Oss颗粒作为低替代率骨材料，目前广泛化应用于临床，已获得公认的临床效果，但其低替代率决定了植骨后长期无法降解［29-30］，这与本研究结果相符，对照组大鼠8周内降解有限，颅骨缺损区域中的新生骨量有限，颅骨缺损区域大部分仍由Bio-Oss颗粒填充，而通过micro-CT三维重建可以发现：植入nHA/PLGA的实验组大鼠颅骨缺损区域中可见明显的新骨形成。理想的人工骨修复材料需要具有良好的生物相容性和骨诱导性，在植入骨缺损区域后能诱导成骨细胞增殖分化，形成新骨，从而取得与自体骨移植类似的骨修复效果。与Bio-Oss颗粒比较，nHA/PLGA纳米复合微球具有更好的降解性和骨诱导性，在微球降解的同时可以诱导新骨的形成。

综上所述，20%nHA/PLGA纳米复合微球在植入骨缺损后获得了理想的骨修复效果，与商品化Bio-Oss颗粒比较，20%nHA/PLGA纳米复合微球生物相容性更好，可在体内降解并诱导新骨形成，因此较低替代率的Bio-Oss颗粒具有更好的临床应用前景。