食品中沙门氏菌快速检测技术方法对比结果分析

◎ 张 华

（临沂市检验检测中心，山东 临沂 276000）

本次研究使用VITEK2 COMPACT全自动微生物分析系统、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）、环介导等温扩增法（Loop-Mediated Isothermal Amplification， LAMP）和实时荧光PCR（Real-Time PCR）等方法[1]，分别对标准菌株和12株沙门菌野生菌株进行测定，对比不同检测方法的优缺点，得出效果更好的检测方法。

1 材料与方法

1.1 菌株

本研究准备了13株沙门菌，其中1株是鼠伤寒沙门氏菌标准菌株，均在广东省食品检验所寄存。菌株经《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）鉴定合格，参照沙门菌属诊断血清鉴定、分型查找Kauffman-White表，将具体的血清型确定下来，相关的菌株信息如表1所示。

1.2 试剂与仪器

沙门氏菌免核酸提取核酸检测试剂盒（产品编号：KF104，苏州先达基因科技有限公司）；VITEK2 COMPACT革兰氏阴性菌鉴定卡（北京普纳德科技有限公司）；细菌基因组DNA快速提取试剂盒（南京钟鼎生物技术有限公司）；沙门氏菌核酸检测试剂盒（苏州先达基因科技有限公司）和NA平板（上海研生实业有限公司）。

QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR仪；AC2-4S1生物安全柜；Deaou-308C恒温扩增荧光检测系统；DHP-9052生化培养箱和MALDI-TOF/TOF 4800基质辅助激光吸解析电离飞行时间质谱仪。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株复苏和分纯

把瓷珠捕获的菌株放在5 min的脑心浸出液肉汤内培养24 h，期间温度控制在35～37 ℃。取培养液1环，接种营养琼脂平板培养24 h，期间温度控制在35～37 ℃，单菌落的纯化工序完成。

1.3.2 VITEK2 COMPACT生化鉴定菌株

挑选以上NA平板中的新鲜单菌落，操作时按VITEK2 COMPACT革兰氏阴性菌鉴定卡的说明书进行，用VITEK2 COMPACT来鉴定菌种，再重复上述流程，鉴定2次即可。

1.3.3 MALDI-TOF MS鉴定菌株

挑选以上NA平板中的新鲜单菌落，厚薄均匀地在VITEK MS靶板上进行涂抹，为避免空气中气凝胶含有的微生物干扰到实验结果，要第一时间将HCCA基质液加进靶孔，等基质晾干，把靶板信息输到质谱仪里面，从而鉴定菌株的种属信息，并重复上述流程，鉴定2次即可[2]。

1.3.4 LAMP鉴定菌株

（1）DNA模板制备。将BHI菌液当作沙门氏菌增菌液，提取时严格按细菌基因组DNA快速提取试剂盒的说明完成。

（2）试剂配制、加样和检测。在试剂的配制、加 样、检测过程中，要严格按沙门氏菌核酸检测试剂盒的说明来完成，并重复上述流程，鉴定2次即可。

1.3.5 Real-time PCR法鉴定菌株

在鉴定上述所备的BHI菌液时，必须严格按沙门氏菌核酸检测试剂盒的操作说明书进行，并重复以上流程，鉴定2次即可。

1.3.6 对比4种方法的鉴定结果

通过比较4种方法得出的鉴定数据，对比4类实验对菌株种属的鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 VITEK2 COMPACT生化鉴定结果

在生化鉴定实验中，被鉴定为沙门氏菌的菌株占比达到100%，其中达到种水平的只有1株特殊血清型的菌株。其余只能达到沙门菌属的水平，2次测定出来都完全相同[3]，具体如表1所示。

表1 4种鉴定方法结果对比表

2.2 MALDI-TOF MS鉴定结果

在该项鉴定实验中，被鉴定为沙门氏菌的菌株占比达到100%，且均达到种的水平，其中有1株是肠沙门菌双相亚利桑那亚种，肠炎沙门氏菌肠亚种12株，两次测定结果一样。

2.3 LAMP鉴定结果

在该鉴定实验中，沙门阳性菌株13株，LAMP引物只能增加目的基因的数量，其中有1株野生型沙门氏菌菌株出现假阴性的鉴定结果，两次测定出来都完全相同，具体如表1所示。

2.4 Real-time PCR鉴定结果

在该鉴定实验中，菌株以沙门阳性体现的占比达到100%，其阳性对照的CI值为19.841，剩余菌株的Ct值只有13.183～16.576，两次测定结果都完全相同[4]，具体可参照表2所示。

表2 4种方法鉴定沙门氏菌检测时间和准确率对比表

2.5 对比4种方法的鉴定结果

从表2可看出，这4种方法，都可以将沙门氏菌准确鉴定出来，从沙门氏菌属的层面分析，准确率为100%，达到了极高的检出率水平，这足以证实，它们在检测沙门氏菌中的表现都相当出色。在检测用时方面，排在第一位的是MALDI-TOF MS，除此之外，在检测期间观察到LAMP会出现假阴性的情况。结合表1、表2中的数据信息对比可以了解到，不论是MALDI-TOF MS还是VITEK 2 COMPACT，都未能提取出3号、7号的亚利桑那沙门氏菌亚种，在对12号菌株进行鉴定的过程中，前者给出的结果不够精确，造成2种方法鉴定沙门氏菌种水平上的准确率直线下滑，前一种只有76%的准确率，后一种达 到84%。

2.6 分析4种方法的鉴定结果

在本次的研究中，荧光定量PCR法运用单对通用引物鉴定沙门氏菌具有较高的准确率和较大的检测量等特点，同时还可以将食物中含量不高的致病菌识别出来，灵敏性极强，由于是单对通用引物，检测只能到属以下，但在实验室快速初筛中非常适用。但要鉴定到种，应采取多重PCR方法，这种方法虽然比较便捷，准确度也高，但极易出现交叉污染的问题，易导致最终结果发生变化。

环介导等温扩增法的准确率极高，方便省时，易判定结果，但可能会出现假阴性的问题。相对于Real-time PCR来说，二者均处核酸层面，步骤相似，特异性好，但Real-Time PCR对温度循环的要求较低，不需要特殊设备，效率也更高[5]。

MALDI-TOF MS本身具有高特异性、高灵敏度、高通量等一系列优点，但在本次的研究中，对于沙门氏菌种层面的准确度不足，其自身可能会受到多个因素的影响，例如对于基质液的选择、病原微生物的培养、菌株的处理和数据库的构建等方面。虽然目前检测所需要的费用与VITEK2 COMPACT相比有一定的减少，但自身的仪器和设备较为昂贵，在使用时，对环境和技术人员都有很高的要求。因此，该方法可以用于大量食源性病株的初步选择，但在基层的推广方面还需要进一步的完善和优化[6]。

VITEK2 COMPACT生化鉴定系统的准确率以及实际的完成率都明显较高，但部分食源性的疾病监测依然处于初期发展模式，其自身的优势为监测费用较低，效率更快。

3 结论

目前沙门氏菌的检测还是以传统的细菌培养、生化反应、血清学实验为主要手段，费时费力，且流程复杂。同时受某些生化试剂、血清质量不稳定、特异性不好等因素的影响，导致鉴定结果误差大，不符合快速检测的标准。因此，传统模式的沙门氏菌培养和分离检测方法，会给食品卫生检测实验室增加负担，不能满足国家的实际需求，而VITEK2 COMPACT的检测模式和方法，可以提高工作效率，减少污染，提高企业的竞争力。

综上所述，从沙门氏菌属角度来看，4种方法都可以将沙门氏菌短时间内检测出来，其中Real-Time PCR、VITEK 2生化鉴定系统以及MALDI可以在国家食品监督抽检、地方监督抽检中作为辅助检验法使用，有助于对LAMP方法进行完善。