多组学数据解析循环及浸润性B 细胞在结直肠癌免疫微环境中的作用

龚其雨，陈 磊

上海交通大学医学院上海市免疫学研究所，上海 200025

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化系统常见的恶性肿瘤之一。CRC 的治疗以手术根治为基础，辅以化学治疗，但仍有近半数患者受困于肿瘤的复发或转移而无有效的治疗手段。CRC 的发生是一个涉及多种癌基因多阶段的突变积累的过程，同时，肿瘤所处的免疫微环境亦起着重要的调控作用［1］。免疫系统因重要的疾病防御与监测功能，近年来一直占据肿瘤治疗的热点，为CRC 的治疗开辟了新的方向［2-3］。在过去10年，肿瘤免疫疗法的临床应用带来振奋人心的成效，但也随着肿瘤内及肿瘤间的异质性而带来一系列问题。以免疫检查点阻滞法（immune checkpoint blockade，ICB）治疗为例，程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）阻断剂在错配修复缺陷与高微卫星不稳定（microsatellite instability high，MSI-H）的转移性CRC 患者中显示出可观疗效，其呈现高水平的肿瘤突变负荷和免疫浸润。相比之下，错配修复和微卫星稳定的CRC 患者则对ICB治疗无应答，其低水平的肿瘤突变负荷和免疫浸润成为治疗抵抗的重要原因［3-5］。因此，免疫微环境在很大程度上决定着CRC 的治疗难度和患者的生存预后。长期以来，以T 细胞为主导，辅以树突状细胞（dendritic cell，DC）、巨噬细胞等抗原提呈的协同抗肿瘤效应长期占据免疫疗法的主流研究方向［6］。然而，B 细胞这类同时兼备抗原提呈及抵御异物的多功能性细胞，在肿瘤微环境，尤其在CRC 的作用却缺乏足够的研究。

随着近年的深入研究，B 细胞在肿瘤免疫微环境中的多样化作用逐步得到人们的重视。B 细胞是多种细胞因子和趋化因子的来源，有重要的调节免疫反应作用，包括引导淋巴组织的发育，塑造和促进效应和记忆T 细胞反应［7-8］，还可通过产生LTα1β2 而独立于淋巴组织诱导细胞驱动三级淋巴组织形成（tertiary lymphoid structure，TLS）［9-12］。此外，B 细胞可产生白细胞介素（interleukin，IL）-10 和IL-35负向调节免疫应答［7］。B细胞和浆细胞可以通过多种机制支持抗肿瘤免疫反应。近年来有研究［13-15］显示，肿瘤组织浸润B 细胞以及肿瘤引流淋巴结中的B 细胞（tumor infiltrating B cells，TIB）和浆细胞在机体的抗肿瘤免疫反应中具有重要作用。一项关于CRC 浸润性B 细胞的研究［16］表明，CD20+B 细胞对CRC 的进展具有良好的预后价值，并证明CD20+B 细胞和CD8+T细胞之间具有显著的相关性。

本研究基于单细胞转录组和抗体库数据的分析，探究B细胞亚型在结直肠癌免疫微环境及肿瘤进展中的作用，比较肿瘤与癌旁浸润性B细胞亚群组成的差异，研究潜在的分子驱动机制，分析B细胞与微环境中免疫细胞的互作关系的变化，寻找可能的调控途径以促进B 细胞的抗肿瘤效应，以期为CRC 的肿瘤免疫治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 样本采集并制备悬液进行单细胞测序

收集来自上海交通大学医学院附属瑞金医院消化科3例患者（均为Ⅰ期/Ⅱ期结直肠癌患者）的手术样本，均无药物治疗。在告知采样标准后，在相同环境条件下收集每位患者的肿瘤、癌旁正常组织以及外周血样本，共9 份。新鲜组织样本经消化后制备成单细胞悬液，经流式分选得到CD45+细胞。血液样本经去红处理后得到外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）。经质控后，采用10X Genomics 技术构建转录组和VDJ 文库进行单细胞测序，测序数据经拼装比对基因组后得到转录组和B细胞抗原受体库（B cell receptor repertoire，BCR）数据。

1.2 构建结直肠癌浸润及循环B 细胞亚群的转录组图谱

转录组数据的初步分析主要使用Seurat 4.0 软件包来完成。首先按照标准化流程处理单个样本，包含以下步骤：质控（表达基因数小于200 和大于8 000的细胞剔除，在少于10 个细胞表达的基因剔除）、按测序深度进行测序数据标准化、log 转化、寻找高变基因（2 000 个）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、K-means 无监督聚类分群，最后用统 一 流 形 逼 近 与 投 影 （uniform manifold approximation and projection，UMAP）实现可视化。

根据文献［17］及实验提供的标记基因分群，将免疫细胞分为以下几群：①T/NK 细胞，标记基因为CD3 delta subunit of T-cell receptor complex（CD3D）、granulysin （GNLY） 和 natural killer cell granule protein 7（NKG7）。②B 细胞和浆细胞，标记基因为CD79a molecule （CD79A）、membrane spanning 4-domains A1（MS4A1）、PR/SET domain 1（PRDM1）和syndecan 1（SDC1）。③髓系细胞，标记基因为interleukin 1β （IL1B）、S100 calcium binding protein A8（S100A8）和cystatin C（CST3）。使用Harmony 3.4 软件包去除批次效应后整合所有样本，按上述标准化流程处理后，筛选出包含浆细胞在内的所有B细胞，根据细胞名称匹配好BCR 数据，按标准化流程处理后重新聚类分群，依据文献参考标记基因分亚群，计算各亚群的在各样本的比例。同时将T/NK 细胞和髓系细胞群按照上述流程进行聚类分群，结果供细胞通信分析使用。

1.3 B 细胞各亚群在正常与肿瘤组织的差异基因和通路富集分析

使用MAST 1.20包计算B细胞各亚群在肿瘤与癌旁正常组织样本的差异基因，选择|log2（fold change）|（|log2（FC）|）大于2，校正后的P值小于0.001 的基因，分别挑选出上调和下调的差异基因，使用clusterProfiler 3.14 包对每个亚群进行差异基因的通路富集分析，按照校正后的P值从小到大排序，在上调和下调的通路中分别选取前10的通路进行生物分析。

1.4 基于TCGA-COAD 数据验证B 细胞各亚群在肿瘤与正常样本的变化

考虑到患者样本数据量过少的原因，为了进一步验证结果的准确性，我们应用CIBERSORTx 1.0 解卷积的方法，将B细胞各亚群的基因表达谱映射到癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的结肠癌数据（Colon adenocarcinoma，COAD）中进行分析，计算各样本中B细胞亚群的特征基因组成得分，比较其在肿瘤和正常组织中的变化情况。同时依据患者的疾病进展信息，分析各个亚群在患者肿瘤进展中的差异变化。

1.5 B细胞亚群与免疫细胞的互作关系分析

将T/NK 细胞以及髓系细胞挑选出进行重新聚类分群后，使用cellphoneDB v3.0 细胞通信软件计算细胞亚群间有统计学意义的分子对，选择校正后P值小于0.05的分子对进行分析，重点关注生发中心B细胞（germinal center B cells，GCB），找出重要调控分子并分析其在免疫微环境的作用。

1.6 B细胞VDJ组库数据分析

以患者为单位，计算B 细胞各亚群的克隆指数，并评估迁移性［18］，使用配对t检验比较组间统计学差异。克隆性评估指数如下：

其中，m代表在亚群C1 和C2 共有的克隆型种数；ni-C代表在亚群C 中克隆型i所含的细胞数；N代表单个样本中每个细胞亚群的细胞总数。

1.7 B细胞抗原受体重链和轻链的突变水平分析

使用工具pRESTO v0.70 进行BCR 的突变水平分析，进行以下质控：去除引物无法识别或比对得分差的序列阅读，保留在单样本至少出现2 次的序列；使用国际免疫基因数据库（ImMunoGeneTics，IMGT）作为参考；除去非功能性序列并除去超过30 个突变的序列；选择对称加权的核苷酸点突变数作为突变位点数。以每群B细胞的突变位点数的平均值代表该细胞群的突变水平，比较其在肿瘤和正常组织中的变化。

1.8 统计学方法

采用R 软件包states v0.3.1 进行统计分析，定量资料包括细胞组成比例、克隆扩增指数及B 细胞重链突变位点数等，以±s形式表示。在肿瘤、正常和血液样本中，细胞群组成比例的差异比较使用Kruskal-Wallis 检验；在TCGA-COAD 的验证数据集中，肿瘤和正常组织的亚群组成比例差异使用独立样本t检验来分析；肿瘤和正常组织中的B 细胞克隆扩增指数的差异分析使用Kruskal-Wallis 检验；在B细胞重链突变水平的分析中，样本间的统计学差异分析使用独立样本t检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫细胞全局及B细胞亚群转录组图谱

我们整合了未经治疗的结直肠癌患者共9 份样本的CD45+免疫细胞，经质量控制及批次矫正整合后分群标注，共得到35 619 个细胞，包含18 246 个T/NK细胞、14 244 个B 细胞和浆细胞及3 129 个髓系细胞（图1A），标记基因如图1B 所示。从细胞在3 种组织的组成比例图可以看出（图1C），T/NK 细胞在肿瘤样本中普遍上升，而B细胞，尤其是浆细胞却普遍减少，初步反映浆细胞在CRC 免疫微环境中的作用有减弱趋势。接下来将所有B 细胞及浆细胞分选出来，并结合8 804 个BCR 阳性细胞辅助分选（图1D），进行后续分析。

图1 免疫细胞全局转录组图谱Fig 1 Transcriptome map of main immune cells

我们对14 244 个B 细胞按标准化流程处理后重新聚类分群，得到如下13 个细胞亚群：GCB、滤泡B 淋巴细胞（follicular B cell，FoB）、未转化的记忆B 细胞（non-switched memory B cell，nsMemB）、转化 的 记 忆 B 细 胞 （switched memory B cell，sMemB）、 高表达热休克蛋白的记忆B 细胞（sMemB-HSP）、高表达免疫球蛋白IgA 的记忆B 细胞（sMemB-IgA）、调节性B 细胞（regulatory B cell，Breg）、浆母细胞（plasmablast，PB），以及表达各类免疫球蛋白亚型的浆细胞（plasma cell，PC），如PC-IGHM、PC-IGHA1、PC-IGHA2、PCIGHA1/2、PC-IGHG1 等。标记基因如图2A、2B 所示。B 细胞各亚群在3 种组织样本中展现出不同的浸润模式（图2C）。相较于正常组织，肿瘤样本中有较多的CD20+B 细胞浸润， 表现在GCB、nsMemB、sMemB 和sMemB-HSP 显著上升（P值分别为0.023、0.002、0.002、0.031），而浆细胞主要以表达IGHM 和IGHA 类（包含PC-IGHA1 和PCIGHA2 这2 类）免疫球蛋白的浆细胞比例显著下降（P值分别为0.021、0.000）。结果表明CD20+B 细胞在肿瘤微环境中作用显著提升，相反，浆细胞（尤其是表达免疫球蛋白IgA 类型的）呈显著下降趋势，表明浆细胞在微环境中的作用大幅削弱。此外，外周血样本的组成中以记忆B 细胞为主，尤其是未经转化的B 细胞，表明记忆B 细胞是循环性B 细胞发挥抗肿瘤效应的主力军。

图2 B细胞亚群转录组图谱Fig 2 Atlas of B cell subclusters in CRC

2.2 基于TCGA-COAD 数据验证B 细胞各亚群在肿瘤与正常组织的差异

我们将B 细胞亚群的单细胞表达图谱映射到TCGA 的COAD 数据中，计算B 细胞亚群的组成得分。如图3A 所示，GCB 在肿瘤显著上升，转化后的记忆B 细胞均显著上升，这与单细胞的分析结果一致。同时，表达IGHA1/2 和IGHG1 类浆细胞显著下降，进一步印证了浆细胞在微环境中作用受到限制。有背景研究报道，IGHG1 类浆细胞是微环境中肿瘤特异性抗体的主要分泌细胞，且可通过NK 细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）及诱导巨噬细胞的吞噬作用来行使抗肿瘤作用。由此推测，浆细胞的抗肿瘤作用受到抑制。GCB 是免疫微环境中记忆B 细胞和浆细胞的生成来源，我们考虑GCB在肿瘤免疫微环境中的发育状态是否有所改变，接下来对GCB在微环境中的变化进行重点关注。

考虑到我们的样本均来自早期CRC患者，于是我们结合TCGA患者的病程信息来分析GCB的变化。如图3B所示，随着疾病恶化，在Ⅰ～Ⅲ期，GCB得分逐渐下降，且差异均具有统计学意义（P值分别为0.003、0.024），提示肿瘤的发展过程中GCB的功能逐步被抑制。在Ⅳ期，虽然GCB特征呈上升趋势，但无统计学意义。

为进一步探究GCB 在肿瘤微环境的驱动下发生了何种变化，我们对肿瘤样本中GCB 的差异基因做了通路富集分析。结果如图3C 所示，GCB 在肿瘤中的抗原提呈功能显著上升，有利地支持了T细胞的激活和增殖，同时自身也在进行有效的VDJ 重排以提高特定抗原亲和力的趋势，具有积极的抗肿瘤效应。而在下调通路中，我们也发现与分泌抗体相关的通路显著下调，这提示我们浆细胞减少的一大原因是否由GCB转化的趋势减少所致。

图3 TCGA-COAD数据分析B细胞亚群在肿瘤与正常组织的组成差异Fig 3 Composition of B cell subsets in tumor and normal tissues by TCGA-COAD data profiling

2.3 GCB与T细胞和髓系细胞的通信分子对

在上述的研究中，我们发现GCB 可能在CRC 的免疫微环境中发挥着积极的作用。为探究外部环境的影响因素，我们进行了细胞通信分析。图4A 所示，为T 细胞与GCB 关系网络中具有统计学意义的通信分子对。可以看出在肿瘤样本中，具有抑制T细胞功能的分子对显著下降，如CD160-TNFRSF14、LTATNFRSF1B、CCL4-CNR2，这对于促进T细胞的杀伤肿瘤作用是有积极意义的［19］。此外，在肿瘤中上升的信号还包括促进T 细胞和B 细胞激活与发育的分子对，如CD27-CD70、CXCL13-CXCR5［20-21］。然而，也存在一些微弱的抑制性信号在肿瘤中增强，如LGALS9-CD44，根据文献报道具有促进并稳定调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）发育的作用，以及CD52-SIGLEC10 抑制T 细胞的功能［22］。这提示我们GCB 在生发中心的功能是多面的，但以促进和激活T 细胞的抗肿瘤作用为主。或许针对GCB 采取措施，特异性激活并提高T细胞功能的信号，抑制其与Treg或耗竭T 细胞的联系，可以有效促进免疫微环境整体的抗肿瘤作用。而在髓系细胞，B 细胞亚群与之通信的情况在肿瘤和正常组织中变化较小。值得关注的是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体家族信号在肿瘤中上调，表明GCB 细胞在微环境中有微弱促进巨噬细胞功能的作用（图4B）。总之，B细胞在CRC免疫微环境中展示的总体作用是促进抗肿瘤效应的信号。

图4 B细胞亚群与T细胞亚群及髓系细胞亚群的通信分子对Fig 4 Interecting pairs between B cell subsets with T cells and myeloid cells

2.4 B细胞各亚群的抗原受体库分析

图5A所示，为B细胞各亚群在3种组织样本的克隆扩增情况。总体比较，B 细胞在正常与肿瘤组织中的克隆指数较PBMC较低，而肿瘤样本与正常组织相比，大部分B 细胞亚群的克隆指数均较低，但GCB与PB 这2 个亚群在肿瘤中均上升，且差异具有统计学意义（均P=0.000），提示它们可能在免疫微环境中受到抗原刺激后积极增殖（图5B、5C）。这对于B细胞的抗肿瘤效应是积极有利的。同时GCB 的B 细胞受体重链在肿瘤中的突变频率也高于正常组织，且差异具有统计学意义（P=0.000），这提示GCB 突变水平在提高，进而有力地提升与肿瘤抗原的亲和力。

图5 B细胞各亚群的克隆扩增情况及GCB在组织的突变水平比较Fig 5 Clonal expansion index of B cell subsets and mutation level of GCB

各亚群间的迁移指数如图6，显示出与转录组一致的分析结果。在正常组织中，CD20+各亚群间的转化指数均较低，GCB 也主要与浆母细胞共享较多的克隆型。而在肿瘤中，GCB与表达IgA类免疫球蛋白的记忆B 细胞有较多的共享克隆型，再次证明GCB在肿瘤中更朝向记忆B细胞发展。

图6 B细胞各亚群在正常(A)、肿瘤(B)和外周血(C)组织中的克隆型迁移指数比较Fig 6 Transition index of B cell subsets among normal(A),tunor(B)and PBCM(C)sample

3 讨论

本研究通过生物信息学分析的方法，基于单细胞转录组及免疫组库数据，对结直肠癌浸润和循环性B细胞进行了详细分析，发现CD20+B 细胞在肿瘤组织中显著上升，以GCB 作用最显著；以通路分析、通信分析以及VDJ 组库数据分析阐释了GCB 的积极作用，发现它在微环境中具有积极的抗肿瘤效应，一方面对T细胞的抗肿瘤效应起到了有力的支持作用，另一方面肿瘤组织中的GCB 自身也在进行高水平的BCR 重链突变，以适应肿瘤抗原进行高亲和力的演变。与之相反的是浆细胞在肿瘤中的作用大幅减少，以表达IgA 类的浆细胞为主，同时GCB 向浆细胞的演化发展在肿瘤组织中逐渐降低，取而代之的是逐步向记忆B 细胞方向的发展。总之，B 细胞在结直肠癌的肿瘤免疫微环境中亦发挥重要作用，它不是简单的旁观者细胞，而是从根本上协调免疫反应的积极参与者。

通过从B 细胞亚群在3 种组织中不同浸润模式研究中确定的CD20+B 重要性， 表现为GCB、nsMemB、sMemB 和sMemB-HSP 的显著上升，同时表达IGHM 和IGHA 类免疫球蛋白的浆细胞显著下降。这提示我们思考B 细胞在肿瘤微环境中发生转变的原因，我们选择记忆B 细胞和浆细胞两者共同的来源——GCB 进行探究。通过将单细胞数据的转录图谱映射到TCGA-COAD 的数据中，我们发现GCB 在肿瘤组织中亦是显著上升的，并且随着肿瘤的进展，GCB 的组成比例逐渐下降，我们猜测可能是由于GCB 在肿瘤发展中功能受到了抑制。经由通路富集分析，我们发现GCB 在肿瘤中的抗原提呈功能显著上升，有利地支持了T 细胞的激活和增殖，同时自身也在进行有效的VDJ 重排以提高特定抗原亲和力的趋势，具有积极的抗肿瘤效应。而在下调通路中，我们也发现与分泌抗体相关的通路显著下调，这提示我们浆细胞减少的一大原因或许是由GCB 转化的趋势减少所致。为了进一步探究微环境对GCB 细胞自身功能的影响，我们通过细胞互作分子对分析发现，具有抑制T 细胞功能的分子对显著下降，同时促进T 细胞和B 细胞激活与发育的分子对也显著上调，展示了GCB 细胞在CRC 免疫微环境中对T 细胞抗肿瘤作用的积极支持。在GCB 与髓系细胞的通信分析中，TNF 的信号增强提示GCB 细胞对于巨噬细胞发挥抗肿瘤效应的潜在支持作用。综合来看，我们认为在早期的肿瘤微环境中，GCB 细胞通过间接的正向支持作用从而发挥积极的抗肿瘤效应。最后，我们通过VDJ 组库数据探讨上述分析结果，从克隆指数和迁移指数两方面评估，发现GCB在肿瘤组织中显著克隆扩增，同时发生高水平的重链突变，这反映了GCB 扩增并提高肿瘤抗原亲和力的趋势。从亚群间的迁移分析，我们发现GCB 在肿瘤组织中更朝向记忆B 细胞的方向发展。然而，究竟记忆B 细胞在结直肠癌的肿瘤免疫微环境中发挥了什么样的作用，在未来的工作中，仍需要进行进一步的探索分析。

综上，对结直肠癌免疫微环境中的B细胞有了初步探索。CD20+B 细胞在肿瘤组织中显著上升，以GCB 作用最显著，通过自身体细胞高频突变以及和周围免疫细胞的联系，发挥积极的抗肿瘤效应。提升GCB 细胞的功能或许是未来免疫治疗的一大方向，可为提升肿瘤的治疗效果提供新思路。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者贡献/Authors'Contributions

龚其雨、陈磊参与了实验设计；龚其雨、陈磊参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The study was designed by GONG Qiyu and CHEN Lei.The manuscript was drafted and revised by GONG Qiyu and CHEN Lei.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-11-18

·Accepted：2022-03-28

·Published online：2022-04-28