哺乳动物细胞表面展示IgG 抗体Fc 组合突变库的构建及评估

张 咪，柳淑君，李福彬，张 燕

上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系，上海市免疫学研究所，上海 200025

单克隆抗体是抗体的一类主要形式，单克隆抗体药物治疗的有效性、安全性和特异性，使其在生物医药领域具有非常重要的地位［1-2］。1986—2021 年，在美国或欧盟获批的抗体治疗药物数量从1 个增至100个［3］；且至2019年11月，共有79种抗体药物正处于后期临床研究实验［2］。为了提高单克隆抗体的药效和成药性，抗体优化技术已经广泛应用于生物制药领域。

其 中， IgG 抗 体Fc （fragment crystallizable domain）的优化是抗体优化的一个重要领域。这是由于Fc 序列的变化决定了抗体与Fcγ 受体（Fcγ recepter，FcγR）、新生儿Fc 受体以及补体蛋白C1q的亲和力。大量研究表明，多种类型IgG 单克隆抗体的活性受到其Fc 与FcγR 相互作用的影响。人和小鼠均表达多种IgG 亚型和多种FcγR。IgG 抗体Fc 与特定FcγR 的结合对其功能有不同的影响，比如IgG1 突变体（S298A/E333A/K334A）提高了其与FcγRIIIA的结合能力，使得FcγRIIIA 介导的抗体依赖细胞毒（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC） 作用增强，从而将该IgG1 突变体（即曲妥珠单抗）对表达人类表皮生长因子受体2 （human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的人乳腺腺癌细胞SK-BR-3 的体外杀伤能力提高了50～100 倍［4］；另一个IgG1 突变体（G236A/S239D/I332E）与FcγRIIA 的亲和力提高了70倍，与FcγRIIA/FcγRIIB亲和力提高了15 倍，可以增强巨噬细胞对抗体靶向细胞的吞噬作用［5］。因此，通过改变抗体Fc与其FcγR 结合属性进而改变抗体功能，是重要的抗体药物优化思路。

抗体Fc 优化的一个主要挑战是IgG 的Fc 部分至少有4 个片段与FcγR 相互作用［6］，直接相互作用的氨基酸位点约20 个。同时，不排除其他部分还可能产生间接影响。如N297 糖基化位点是人IgG 与FcγR结合的中心，N297A 突变可导致IgG 与FcγR 不能结合［7］；P396L 突变可导致ADCC 活性增加［8］。因此，优化抗体Fc 与FcγR 结合能力时需要同时考虑的氨基酸位点较多，这使得Fc 的突变文库非常大。同时，翻译后修饰对Fc 和FcγR 相互作用也具有重要影响，使得抗体Fc 的优化只能依托真核细胞表达平台。哺乳动物细胞展示系统是表达和分泌人类抗体最天然的系统。然而，相对于文库多样性可达到1010的噬菌体展示系统和107的酵母展示系统，哺乳动物细胞展示系统的筛选效率在很大程度上受到稳转文库规模小（约104）的限制［9］。如何有效地实现更大范围的Fc突变筛选，一直是一个重要的问题。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

3T3 细胞来源于美国典型培养物保藏中心（ATCC）；Phoenix细胞和Helper辅助质粒由上海交通大学医学院黄传新博士课题组馈赠；同源重组试剂盒（Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit，货号10912ES10）购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；高保真DNA 聚合酶Pfu（货号AP231）和大肠埃希菌（E. coli）DH5α 感受态细胞（货号CD201）购自北京全式金生物技术股份有限公司；PEI 转染试剂（货号：24765-2）购自美国Polysciences 公司；胶回收试剂盒（Gel extraction kit，货号D2500-02）、无内毒素质粒大抽试剂盒（Endo-Free Plasmid DNA Maxi Kit，货号D6926-03）购自美国Omega Bio-tek 公司；Polybrene 助转染试剂（货号GM-040901）购自吉满生物科技（上海）有限公司；PBS 缓冲液（货号B320KJ）购自上海源培生物科技公司；DAPI 荧光染料（货号D3571）购自美国Invitrogen公司；蛋白酶K（货号B600452）、1 mol/L Tris-HCl pH 8.0 溶液（货号B548127）、NaCl （货 号A100241） 和SDS （货 号A100227） 购自生工生物工程（上海） 股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 简并引物的设计和PCR 以实验室已有的哺乳动物表面展示载体MIGR1-IgG2［该载体具有的特征是在膜表面表达人抗体IgG2 的同时也会表达绿色荧光蛋白（GFP）］为模板，设计简并引物（引物序列中除正常碱基外为简并碱基：R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T）。对合成的简并引物进行等比例混合（不考虑引物所含突变多样性，直接等量混合）或者按该条引物所携带的突变数占总文库多样性的比例进行混合（例如：简并引物编号为1 的引物包含3 072 种突变，则其占比为3 072/41 600×100%=7.38%，那么取7.38 μL 该引物，其他引物也按照计算的比例加入，混合）。然后进行PCR使目的片段和线性化MIGR1-IgG2 载体具有相同末端序列，并根据胶回收试剂盒说明书对其进行纯化。

1.2.2 抗体Fc 突变质粒文库的构建 纯化后的具有相同末端序列的线性化载体和插入片段，通过同源重组酶进行重组反应。取10 μL 上述反应产物加至100 μLE. coliDH5α 感受态细胞，冰上静置30 min，42 ℃热激90 s，冰上放置2 min，加入500 μL LB 培养基，于37 ℃，摇床200 r/min 孵育30 min 后，取少量DH5α 菌液涂平板，过夜培养，次日计算克隆数。当克隆数为文库大小的2～5倍时，认为该文库构建成功，并且将这些单克隆菌落，进行一代测序（Sanger测序），检测文库的质量。余下的DH5α 菌液，进行大规模培养，用无内毒素质粒大抽试剂盒提取质粒，获得质粒文库。

1.2.3 抗体Fc 突变细胞文库的构建 将上述大抽质粒文库和Helper 辅助质粒（摩尔比为2∶1），与转染试剂PEI（总质粒与PEI 质量比为1∶5）混合，转染提前铺板的Phoenix 细胞（融合度为50%～60%），6 h后更换新鲜培养基，48 h后收集含有反转录病毒的上清液。将该上清液与新鲜DMEM 培养基1∶1 混合，并加入Polybrene（终浓度为8 μg/mL），混匀后感染提前铺板的3T3 细胞（融合度为50%～65%），24 h 后换液，48 h后即可获得表达抗体Fc突变的细胞文库。

1.2.4 流式细胞术分析Phoenix 细胞的转染效率和3T3 细胞的感染效率 胰酶消化收集Phoenix 细胞或者3T3 细胞，制备单细胞悬浮液，PBS 缓冲液洗涤2 次，并用含有DAPI（0.5 μg/mL）的200 μL 流式染色缓冲液重悬细胞，通过流式细胞仪分析。流式细胞术结果用FlowJo软件分析。

1.2.5 基因组DNA 提取 取约1.5×106个3T3 细胞，500×g离 心5 min 取 上 清 液，PBS 缓 冲 液 洗 涤1 次，200 μL 无SDS 的基因组DNA 缓冲液［100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）、 1 mmol/L EDTA］重悬，并加入4 μL浓度为10 μg/μL蛋白酶K，吹打混匀。然后加入200 μL 含有SDS 的基因组DNA缓 冲 液［100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、1 mmol/L EDTA、1%SDS］，37 ℃反应4 h。反应结束后，加入400 μL 异丙醇，上下翻转混匀，将会看到DNA 析出。然后用枪头挑出DNA，加入800 μL 70%乙醇洗涤。再挑出DNA 晾干，最后加入100 μL ddH2O溶解，即获得细胞基因组DNA。

1.2.6 高通量测序评估文库构建情况 取大抽质粒约60 ng或者待分析细胞DNA作为模板，自建库进行高通量测序（PE150），获得500 万～800 万条序列。使用Flash 程序对数据进行拼接，得到高通量测序原始数据。提取突变区域的核苷酸序列，将其批量翻译成对应的氨基酸序列（http：//www.cbs.dtu.dk/services/VirtualRibosome/）［10］，在Rstudio 和Excel 中进行数据分析，计算期望文库突变在总文库中出现的频率。

2 结果

2.1 筛选与FcγRIIB 亲和力增强的氨基酸单点突变

为了缩小影响FcγRIIB 亲和力的氨基酸突变的范围，我们首先选择可能有直接影响的氨基酸位点，包括4 个区域，分别为EU 编号233～240、265～269、297～299、327～333 的位点［6］，对其进行单点的任意突变，并通过筛选确定这些氨基酸突变。结果显示，流式细胞术分选后，与FcγRIIB 结合的细胞比例逐步增多（图1）。对分选前后细胞进行测序分析，与野生型相比，表1 中的氨基酸增强了抗体Fc 与FcγRIIB的亲和力。本研究选取区域1（EU 编号233～240的位点）构建Fc组合突变文库。

第七，合理使用中药和益生菌添加剂。在抗生素限用的时代，在防控疾病时，尽量采用中药类制剂和微生态制剂，这样可以避免残留的发生，当然尽量做到不发病才是最好的。

图1 分选前后点突变文库的检测Fig 1 Analysis of point mutation libraries before and after sorting

表1 EU编号233～240位点与FcγRIIB亲和力增强的氨基酸Tab 1 Amino acids with enhanced affinity for FcγRIIB at 233-240 of EU numbring

2.2 高容量Fc组合突变质粒文库的构建

由于多个氨基酸同时参与IgG 抗体Fc 和FcγR 相互作用，各个氨基酸位点突变并非简单的加减关系，而可能具有复杂的相互影响。我们推测，同时考虑多个氨基酸位点的突变组合对获得更好的优化序列是必要的。因此，我们在已经获得的单点氨基酸突变的基础上，构建能够覆盖全部区域1 的氨基酸位点的组合突变文库。

根据表1所示氨基酸设计简并引物（表2），利用多个简并引物构建质粒文库，使得组合突变文库包含表1 所示的所有突变氨基酸组合，同时尽可能降低简并引物带来的其他氨基酸突变。文库中所包含的突变种类有11 520种（期望文库多样性，其计算方法为每个位点氨基酸种类相乘的结果，即6×4×4×4×5×3×2=11 520 种），增加到41 600 种（实际文库多样性，其计算方法为32 条简并引物包含的突变氨基酸种类相加：3 072+256+……+1 152+96=41 600 种），是期望文库多样性的3.6倍。

表2 简并引物的序列Tab 2 Sequences of the degenerate primers

2.3 按比例添加简并引物可提高文库的均一性与完整性

将简并引物按等比例或者按引物所包含突变多样性占比混合，进行PCR 连接转化制备质粒文库，对质粒文库进行高通量测序分析。结果（表3）显示：等比例混合引物时，在组合突变质粒文库中有10 855种为期望文库中的组合突变，即所构建的质粒文库覆盖了期望文库中94.24%的组合突变，突变出现频率大于等于10-6的比例为82.38%；而按一定比例混合引物时，在组合突变质粒文库中有11 472种为期望文库中的组合突变，即所构建的质粒文库覆盖了期望文库中99.58%的组合突变，且出现频率均大于等于10-6。随机选取10 个单克隆菌落进行一代测序，结果（表4）显示，10 条序列中有3 个为期望文库的序列，另外7 个为简并引物所引入的新的组合突变，同时比例也与上述3.6 倍基本相符。我们选取按突变种类占比混合引物制备的质粒文库进行后续实验。

表3 简并引物等比例混合和按突变种类占比混合后质粒文库的检测结果Tab 3 Results of plasmid library after the degenerate primers mixed with equal proportion or according to the proportion of mutation diversity

表4 EU编号233～240位点Fc组合突变文库的Sanger测序结果Tab 4 Sanger sequencing results of Fc combined mutation plasmid library at 233-240 of EU numbering

2.4 高容量Fc组合突变细胞文库的构建

为了确保文库中上万种突变能通过转染产生反转录病毒，而后感染3T3 细胞表达膜IgG，需要根据转染效率来确定被转染的Phoenix 细胞数量以及被感染的3T3 细胞数量。因此，本研究中，我们按照转染/感染效率为40%，实际感染或感染细胞数为文库的100 倍，转染/感染时Phoenix 细胞/3T3 细胞融合度为50%，这3 个标准确定2 个15 cm 细胞培养皿的细胞数量即可满足转染/感染要求。

转染Phoenix 细胞48 h 后，流式细胞术检测Pheonix 细胞的包装病毒时的转染效率。结果（图2A）显示，与未转染的Phoenix 细胞相比，Phoenix细胞突变文库的GFP 表达水平为51.6%。反转录病毒感染3T3 细胞，48 h 后检测3T3 细胞感染效率，结果（图2B）显示，约有47.4%的3T3 细胞有GFP 信号，提示细胞文库初步构建成功。

图2 Phoenix细胞的转染效率（A）及3T3细胞的感染效率（B）Fig 2 Transfection efficiency in the Phoenix cells(A)and infection efficiency in the 3T3 cells(B)

2.5 高通量测序检测Fc组合突变细胞文库的质量

取转染后的细胞提取DNA，进行高通量测序。结果（表5）表明，期望的组合突变在实际细胞文库中可以检测到9 898 种，占期望文库的85.92%，只有14.08%的突变没有被检测到，成功构建了包含大部分期望氨基酸组合突变的细胞文库。

表5 Fc组合突变细胞文库的高通量测序结果分析Tab 5 Analysis of high throughput sequencing results of Fc combined mutant cell library

3 讨论

单抗药物的研发技术和平台日渐成熟，其中通过重组抗体的方式在体外进行抗体文库的构建已经成为单抗药物研发的重要手段。为了能够更加系统、全面地模拟自然突变的情况，需要设计高通量的抗体文库。目前构建抗体文库的方法主要有定点突变、硅蛋白设计［6-7］、噬菌体展示和酵母展示技术［8-10］等。其中，定点突变和硅蛋白设计方法受通量和成本的限制［11-12］；而高通量噬菌体展示和酵母展示技术，前者无法进行Fc 糖基化修饰，后者展示的糖蛋白包含高甘露糖，使得抗体在血清中会被很快清除［13-15］。哺乳动物细胞展示技术可以解决上述障碍，并可以在细胞表面展示具有正确折叠和翻译后修饰的全人源化抗体［16］。本研究中，我们提供了一个基于单点突变文库的筛选结果，分步构建大容量多组合突变文库的方法，用于哺乳动物表面展示技术对Fc 变体的筛选。与前述方法相比，该技术有2 个优点：①所构建的文库大小可达到105，属于高通量，便于后续筛选。②可进行翻译后糖基化修饰，是Fc 工程的理想平台。利用这种方法，我们成功构建了4.16×104多样性的组合突变质粒文库及对应细胞文库。高通量测序分析这些文库结果显示实际文库能够覆盖期望组合突变的99.58%（质粒文库）或85.92%（细胞文库），为后续构建更高容量突变文库及高通量筛选Fc 组合突变变体打下了坚实的基础。

Fc工程改造增加对FcγRIIB的结合能力被认为是一种有前景的方法。基于IgG1 的Fc 突变体V12（E233D/G237D/H268D/P271G/Y296D/A330R）［12］是目前已知的最大程度增强与FcγRIIB 的结合能力，且不增加与其他活化型FcγR 结合能力的Fc 变体。该研究在抗体铰链下游区域和CH2 区域的约30 个氨基酸进行定点突变建库筛选，并且考虑了从Fc/FcγRIIB复合体的晶体结构来优化Fc 变体。其不足之处是V12 变体是通过定点突变方法发现的，受通量的限制，所有的变体数加起来不到1 000 个。与此相比，本研究有3 个方面的优势：①建库分为2 步，首先在区域1 的7 个位点获得与FcγRIIB 高亲和力的氨基酸，然后基于这些氨基酸再进行组合突变。在Fc 中与FcγRIIB 相结合的4 个区域内，除了第3 个区域包含的氨基酸位点较少，其余的氨基酸个数为5～7个，如果要进行组合突变文库的构建，直接用简并引物的方法构建，每个位点包含20 种可能，所构建的文库容量将达到205～207。根据现有条件，利用哺乳动物细胞表面展示法处理容量如此大的文库有技术限制，而且后续的分选工作也难以进行。因此，本研究先对单点突变文库进行了一轮筛选，获得与FcγRIIB 高亲和力的一些氨基酸，以这些与FcγRIIB 有结合优势的氨基酸突变为基础，进行组合突变时可缩小文库的大小，使得后续的文库构建和分选更易进行。②利用简并引物来构建文库时，按照每条引物所包含突变多样性占比混合引物制备的文库更均一，实际文库覆盖期望文库的比例更高，在质粒文库中能够达到99%以上。同时，一代测序结果中，出现的突变个数的比例也正好符合实际文库和期望文库的比值。③效率高，成本低。设计包含11 520种突变的文库，若每种组合突变合成1 条引物，则需要合成11 520 条引物，成本太高，而且操作起来极其困难。本研究仅用32 条引物就可以通过PCR 产生上万种突变，每条引物能包括多种可能性，同时又尽可能降低了文库的大小，既节省了成本，又大大降低了操作难度。

质粒文库准备就绪之后，需要通过反转录病毒感染3T3 细胞获得细胞文库。与对照相比，Phoenix 细胞包装病毒的效率为51.6%，而3T3 细胞被感染的效率为47.4%，基本符合预期，初步提示文库构建成功。最后，再通过高通量测序检测细胞文库的完整性，结果显示，85.92%的突变包含在细胞文库中，未检测到的突变原因有可能是因为高通量测序所使用的模板不能够完全覆盖我们所制备的细胞文库导致的。不过上述质粒文库和细胞文库的高通量测序结果也显示我们构建了高质量的抗体Fc 组合突变文库。这说明本研究的设计可以为抗体文库的构建提供一种较好的方法思路。

综上所述，本研究成功构建了一个包含41 600种IgG-Fc变体的组合突变膜抗体库。通过简并引物获得质粒文库，成本低且易操作，为构建细胞文库提供了基础。哺乳动物细胞表面展示技术获得的抗体库，具有可展示全长抗体、高通量、可进行糖基化修饰等优点，因而展示的抗体在分子结构、理化特性和生物学功能方面接近于天然的高等生物蛋白质分子。在进行质粒转染或者病毒感染的过程中，较难保证只有1 种外源DNA 进入单个细胞。不过，我们在实验设计时将被感染成功的细胞数设定在实际文库大小的100 倍左右，保证了只有多次进入细胞并且编码高亲和力Fc 突变序列才会被筛选出来，尽量减少筛选结果的随机性。哺乳动物细胞表面展示技术具有很大的优势与开发潜力，本研究中所讨论的建库方法适用于所有类型的蛋白，并不局限于IgG，还可用于单链可变区片段（ScFv）［17］、病毒膜蛋白［18］等。

利益冲突声明/Conflict of Interests

上海交通大学医学院已申请专利“FcγRIIB 亲和力增强的抗体Fc区”（PCT/CN2020/133685，待审），发明人为李福彬、张燕、张咪、毕艳侠、田世豪、张慧慧和柳淑君。所有作者声明不存在其他利益冲突。

A patent application titled “Antibody Fc region having enhanced FcγRIIB affinity” has been filed by Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （PCT/CN2020/133685， pending）， and the listed inventors are LI Fubin， ZHANG Yan， ZHANG Mi， BI Yanxia， TIAN Shihao， ZHANG Huihui， and LIU Shujun.All the authors disclose no other relevant conflicts of interests.

作者贡献/Authors'Contributions

李福彬、张燕参与了实验设计；张燕、张咪参与了实验操作；张燕、张咪和柳淑君参与了数据分析；张咪、张燕和李福彬参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The study was designed by LI Fubin and ZHANG Yan. The experiments were performed by ZHANG Yan and ZHANG Mi. The results were analyzed by ZHANG Yan， ZHANG Mi and LIU Shujun.The manuscript was drafted and revised by ZHANG Mi， ZHANG Yan and LI Fubin. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-12-01

·Accepted：2022-04-25

·Published online：2022-04-28