基于垂直密度梯度离心全自动血脂谱检测法的家族性高三酰甘油血症家系血脂亚组分分析

何志洁，何津春，2，张燕培，王耀东，王占科

1. 兰州大学第一临床医学院，兰州 730013；2. 兰州大学第一医院检验科，兰州 730013；3. 宁波美康盛德医学检验所，宁波 315105

家 族 性 高 三 酰 甘 油 血 症 （familial hypertriglyceridemia， FHTG） 是 以 三 酰 甘 油（triacylglycerol，TAG）合成增加为特征的常染色体显性遗传病，可导致过量的富含TAG 的极低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein，VLDL） 颗粒产生，成年人发病率为5%～10%［1-2］。FHTG患者血清TAG水平通常为2.26～7.91 mmol/L（200～700 mg/dL）［3］，然而，由于TAG 水平受饮食和时间等因素的影响，在正常生理状态下处于波动状态，所以同一个体在多次测定时，TAG 值可能有较大差异［4］。因此，仅依靠患者血脂水平、个人病史及家族史等临床资料进行FHTG 的诊断存在一定的误诊率，所以有必要联合其他标志物进行辅助诊断。垂直密度梯度离心全自动血脂谱检测法（vertical auto profile，VAP）基于经典的超速离心法，将主要类别的脂蛋白分离为各自的亚组分；该技术最大限度地保留脂蛋白原始的颗粒状态，较为真实地反映出血浆脂蛋白的分布状态，是脂蛋白分离的参考方法［5］。本研究应用VAP 对一个FHTG 家系的成员进行血脂亚组分的测定，以期找到新的可用于FHTG 诊断和鉴别诊断的指标，从而为FHTG 的早期诊断和筛查提供新手段。

1 对象与方法

1.1 纳入标准

根据FHTG 家系诊断标准［6］：包括先证者在内，家系中至少有2 个一级亲属血清TAG≥2.26 mmol/L，总胆固醇（total cholesterol，TC）<5.18 mmol/L；家族其他成员中无其他类型的高脂蛋白血症。

1.2 研究对象及分组

收集兰州大学第一医院1 个符合FHTG 家系诊断标准的FHTG 家系。该家系来源于国家“十五”重大科技专项“重大疾病遗传资源的收集、保存与利用”的子课题“Ⅱ、Ⅳ型遗传性高脂血症家系血标本收集及临床流行病学研究”（2002BA711B08-17）的积累，均已排除因内分泌疾病等继发性因素导致TAG升高的家系成员。纳入研究的家系成员共3代13人：FHTG患者7人，血脂正常6人；男性7人，女性6人。根据TAG是否升高（≥2.26 mmol/L），将家系成员分为高TAG组（n=7）和对照组（n=6）。

1.3 临床资料收集

通过对家系成员身高、体质量、腰围等一系列指标的检测，填写“家系调查表”，同时收集家系成员的年龄、性别、生活习惯及病史等一般资料，并计算体质量指数（body mass index，BMI）。

1.4 检测方法

抽取13 位家系成员空腹血5 mL，低速离心2 533×g5 min 后将血清分为2 份。1 份血清标本于2 h内在兰州大学第一医院使用美国Beckman Coulter AU5800 全自动生化分析仪进行生化项目（血脂、血糖、肝功能、肾功能）检测。另1 份血清标本经2～8 ℃的冷链运输至宁波美康盛德医学检验所采用VAP检测血脂亚组分［5，7］。

1.4.1 生化指标检测 血脂检测指标包括TC、TAG、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）、载脂蛋白AⅠ（apolipoprotein A Ⅰ，apo A Ⅰ）、载脂蛋白B（apolipoprotein B，apo B）、脂蛋白a ［lipoprotein（a），Lp （a）］。LDL-C、HDL-C 的检测使用美国Beckman Coulter 公司配套原装试剂，TC、TAG、apo AⅠ、apo B、Lp （a）的检测使用北京九强生物技术有限公司测定试剂盒。

1.4.2 血脂亚组分检测 在特制的梯度介质内将血浆快速垂直离心后，得到脂蛋白分层的样本。随后将离心后的样本放在血脂亚组分检测仪（MS-V600）上，仪器将离心管的底部戳破，分层的脂蛋白从离心管底部流下来，并依次与胆固醇试剂反应，获得连续的脂蛋白胆固醇检测图谱。通过软件计算出每种脂蛋白胆固醇的含量，包括TC、TAG、LDL-C、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、VLDL、极低密度脂蛋白3 （very-low-density lipoprotein 3，VLDL3）、HDL-C、高 密 度 脂 蛋 白2 （high-density lipoprotein 2，HDL2）、高密度脂蛋白3（high-density lipoprotein 3， HDL3）、 中 间 密 度 脂 蛋 白（intermediate-density lipoprotein，IDL）、脂蛋白残粒（remnant-like lipoprotein particle，RLP）、非高密度脂蛋白（non-high-density lipoprotein， non-HDL）。基于LDL 最大时间值分析LDL 密度模式：小而密LDL（B 型）对应的时间（≤115 s），大而疏LDL（A 型）对应的时间（≥118 s），中间密度（A/B型）介于两者之间［5］。在生化仪上使用胶乳增强免疫比浊法测定Lp （a）浓度。

利用垂直脂蛋白图谱法（vertical lipoprotein profile，VLP）检测低密度脂蛋白颗粒（low-density lipoprotein particle，LDL-P），利用垂直梯度超速离心法分离各类脂蛋白，随后利用位于VLP 分析仪上的检测器，通过检测器的多角度激光散射来测定LDL组分中的LDL-P浓度。

使用MS-V600 型VAP 血脂亚组分检测仪（江西美康盛德生物科技有限公司）检测IDL、VLDL3等指标，使用MS-V800 型血脂颗粒检测仪（江西美康盛德生物科技有限公司）检测血清LDL-P。血脂亚组分、Lp （a）和LDL-P检测所需试剂盒及其配套检测设备均为该公司产品。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件对资料进行统计分析。定量资料以±s表示，采用独立样本t检验进行2 组间比较；定性资料以n（%）表示，采用Fisher 确切概率法进行2组间比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 家系系谱图

根据临床资料绘制FHTG 家系系谱图，见图1。对照组：Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ6。高TAG组：Ⅰ2、Ⅱ4、Ⅱ6、Ⅱ8（先证者）、Ⅲ3、Ⅲ4、Ⅲ5。先证者Ⅱ8，患FHTG 36年；先证者一代亲属Ⅰ2，患FHTG 38 年；先证者二代亲属Ⅱ4，患FHTG 22年；先证者二代亲属Ⅱ6，患FHTG 25 年；先证者三代亲属Ⅲ3，患FHTG 16 年；先证者三代亲属Ⅲ4，患FHTG 3 年；先证者三代亲属Ⅲ5，患FHTG 17年。

图1 家系系谱图Fig 1 Pedigree diagram of the family

2.2 一般资料

本研究纳入的FHTG 家系成员中，高TAG 组身高、体质量、BMI、腰围明显高于对照组（P=0.022，P=0.000，P=0.001，P=0.000），且2 组间性别差异有统计学意义（P=0.029），2 组间年龄差异无统计学意义（P=0.561），见表1。

表1 FHTG家系成员基本特征Tab 1 Basic characteristics of FHTG family members

2.3 家系成员临床特征

家系成员听、触、叩诊均无异常。实验室检查：临床常规血脂检测指标中，高TAG 组TAG 水平高于对照组（P=0.002），高TAG 组apo AⅠ、HDL-C 水平均低于对照组（P=0.004，P=0.001），见表2。家系成员血糖、肝功能、肾功能检查结果均无异常。

表2 FHTG家系成员临床常规血脂检测指标Tab 2 Clinical routine blood lipid detection indicators of FHTG family members

2.4 家系成员全血脂谱检测图谱

全血脂谱检测图谱将每种脂蛋白定性和定量的信息以脂蛋白峰的位置、高低及形状表示。对比家系成员全血脂谱检测图谱，可见：与对照组中Ⅱ3（图2）相比，先证者（高TAG 组Ⅱ8）血脂异常特征性的形状为HDL 水平降低，VLDL 水平明显升高（图3）。VAP 方法基于LDL 最大时间值识别LDL 密度模式，小而密LDL 对应的时间较短（≤115 s）［5］。先证者LDL 最大时间值较对照组Ⅱ3 低，LDL 的峰值更靠近小而密LDL，主要LDL 密度模式为小而密。

图2 对照组Ⅱ3全血脂谱检测图谱Fig 2 Whole blood lipid profile detection of control group Ⅱ3

图3 高TAG组Ⅱ8（先证者）全血脂谱检测图谱Fig 3 Whole blood lipid profile detection of high TAG group Ⅱ8(proband)

2.5 血脂亚组分检测结果

LDL 密度模式分为B 型（小而密）、A 型（大而疏）和A/B 型（中间密度）。FHTG 家系高TAG 组LDL 密度模式均为B 型（LDL 以小颗粒致密型为主），对照组LDL 密度模式为A 型（LDL 以大颗粒疏松型为主）或A/B型（介于两者之间），见表3。

表3 FHTG家系LDL密度模式比较Tab 3 Comparison of the LDL pattern in FHTG family

FHTG 家 系 高TAG 组TAG、VLDL、VLDL3、LDL-P 水平均高于对照组（P=0.003，P=0.033，P=0.020，P=0.043），高TAG 组HDL-C、HDL2、HDL3水平均低于对照组（P=0.000，P=0.001，P=0.001），其他指标差异均无统计学意义。见表4。

表4 FHTG家系血脂亚组分比较Tab 4 Comparison of plasma lipoprotein subfractions in FHTG family

3 讨论

根据流行病学研究数据，中国18 岁以上人群高三酰甘油血症患病率为12.17%，是中国人群血脂异常的主要类型［8］。研究［9-10］显示，血脂异常已经成为急性胰腺炎的第二大病因，而TAG 水平显著升高［TAG≥1 000 mg/dL（11.30 mmol/L）］与血脂异常引起的急性胰腺炎密切相关。此外，有研究［11］显示TAG水平升高也可增加心血管病的风险。而FHTG是常见原发性高三酰甘油血症的主要类型，应引起重视。目前FHTG 家系临床诊断主要依靠血清（浆）TAG 水平，但TAG 水平在个体内及个体间变异大，同一个体多次测定时，TAG 也可能有较大差异，且TAG 受饮食和空腹时间的影响较大，因此传统的普通血脂检测存在一定的局限性，在临床诊断时会造成一定的误诊率［12-13］。VAP 血脂分型检测是一种高度敏感的直接检测各类脂蛋白及其亚组分浓度的方法，可以同时检测多种脂蛋白并能保证脂蛋白测定的准确性，从而比传统的血脂指标更好地识别风险患者［5］。

本研究通过VAP检测一个FHTG家系成员的血脂亚组分，以了解FHTG 家系成员血脂亚组分的特征，寻找可用于诊疗的依据。FHTG血脂表型为TAG轻度至中度升高、TC 水平正常［1］。本家系内高TAG 组TAG 水平明显高于对照组，2 组之间TC 水平差异无统计学意义，与文献报道结论一致。此外，已有研究［14］表明体质量及体脂分布状态对血浆TAG水平影响显著，超重（BMI≥24 kg/m2）和肥胖（BMI≥28 kg/m2）人群的TAG 水平明显高于正常人群。本研究结果显示高TAG 组BMI 明显高于对照组，提示超重可增加FHTG 发生的风险，因此，BMI 可以作为FHTG 筛查的一项指标。

本研究显示，通过VAP技术检测FHTG家系血脂亚组分，该家系血脂亚组分的特征是高TAG 组VLDL、VLDL3、LDL-P 水平较对照组高，HDL-C、HDL2、HDL3水平均低于对照组。高TAG 组LDL 密度模式均是小而密，提示小而密LDL 伴有较高的FHTG 风险。且全血脂谱检测图谱中有血脂异常特征性的形状，因此，结合VAP 提供的定量脂蛋白信息，图谱轮廓的形状有助于识别FHTG。FHTG 的常见突变类型是脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）基因的杂合失活突变，该突变导致VLDL核心内的TAG水解程度降低。VLDL颗粒相对稳定，TAG 含量增加导致VLDL 颗粒尺寸增加。大的VLDL 颗粒不是LPL的最佳底物，因此水解速度很慢，导致循环中富含TAG的大体积VLDL颗粒增加［3］。本研究FHTG家系中高TAG 组VLDL 和VLDL3较对照组高，与已有结论一致。

目前，关于FHTG 是否为心血管疾病的独立危险因素尚存有争议［15］。心血管疾病的残余风险（通过降血脂药物的有效治疗后，虽然患者LDL-C 水平已达标，但部分患者仍可能出现心血管疾病相关事件）与TAG 水平增高密切相关［16-17］。也有研究［18］发现，TAG 水平增高与心血管疾病的发生无明显相关。在本研究中，通过测定血脂亚组分、脂蛋白胆固醇含量及脂蛋白颗粒浓度，发现FHTG 家系中高TAG 组血清TAG、VLDL、VLDL3、LDL-P 较对照组显著升高，HDL-C、HDL2、HDL3水平较对照组显著降低，且高TAG 组均为小而密LDL。而已有的大量研究［19-21］表明VLDL、小而密LDL、HDL-C、HDL2、HDL3均与心血管疾病的发生发展密切相关。TAG 轻至中度升高常反映VLDL 及其残粒（颗粒更小的VLDL）增多，这些残粒脂蛋白由于颗粒变小，可能具有直接致动脉粥样硬化的作用［4］。VLDL中的TAG和HDL、LDL 中的胆固醇酯进行交换，引起血清中小而密LDL 颗粒的浓度升高和HDL-C 水平降低，脂质交换后生成的小而密LDL 颗粒具有很强的致动脉粥样硬化作用。小而密LDL 颗粒小，更容易进入动脉内膜下层，并滞留在动脉管壁，加之小而密LDL的清除过程缓慢，进一步延长了在动脉管壁的滞留时间，由此诱导巨噬细胞形成泡沫细胞，最终导致动脉粥样硬化斑块形成［22］。动脉粥样硬化是脑梗死的主要原因及重要因素［23］，且本实验中家系成员Ⅰ2、Ⅱ4（2015 年）均已发生脑梗死，进一步表明FHTG 可能为心血管疾病的独立危险因素。因此，根据本研究结果，FHTG 与心血管疾病的发生发展有密切的关系，这提示血脂亚组分的测定对于FHTG 及心血管疾病的诊断有重要意义。

由于“三口之家”的小家系日趋成为家庭主体，符合要求的家系难以获取，家系资源更显珍贵，所以今后有必要进一步加快FHTG 等家系收集，以明确血脂亚组分的特征，进而阐明FHTG 与动脉粥样硬化及心脑血管疾病的关系。

综上所述，本研究发现除临床常用的TAG 和HDL-C 外，VLDL3、VLDL、LDL-P、小而密LDL、HDL2、HDL3也有助于FHTG 的诊断和鉴别诊断，并可对疾病的风险评估提供指导建议。血脂亚组分测定可能为今后精准检验提供思路和方法。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

伦理批准和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有实验均已通过兰州大学第一医院科学伦理委员会的审核批准（文件号LDYYLL2021-285，日期2021-08-30）。所有实验过程均遵照《药物临床试验质量管理规范》的条例进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by Ethics Committee of First Hospital of Lanzhou University（Approval Letter No. 2021-285， dated 2021-08-30）， and all experimental protocols were carried out by following the guidelines ofGood Clinical Practice. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者贡献/Authors'Contributions

何志洁、何津春、张燕培参与了实验设计；何志洁、何津春、张燕培、王耀东、王占科参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The study was designed by HE Zhijie， HE Jinchun and ZHANG Yanpei. The manuscript was drafted and revised by HE Zhijie， HE Jinchun， ZHANG Yanpei， WANG Yaodong and WANG Zhanke.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-12-27

·Accepted：2022-04-10

·Published online：2022-04-28