妊娠期糖尿病对C57BL/6J 子代成年鼠神经精神功能的影响

吴侠霏，方 婕，漆洪波，2，余昕烊

1.重庆医科大学附属第一医院妇产科，重庆 400016；2.重庆市妇幼保健院，重庆 400010

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指妊娠期发现的不同程度的糖代谢异常。目前，我国GDM 的发病率已达17.5%～18.9%，已然成为妊娠期最常见的合并症之一［1］。宫内高糖环境致胎儿高胰岛素血症、组织慢性缺氧以及氧化应激等风险增加［2-3］。健康与疾病发育起源（development origins of health and disease，DOHaD）学说指出：在生长和发育的关键时期经历不利因素可能对后代健康产生影响，这些影响不仅发生在儿童发育的早期阶段，还可能潜伏多年，在成年期表现出来［4］。GDM子代在孕期暴露于高糖环境，远期代谢性并发症以及神经精神发育障碍等疾病的易感性显著上升［5-6］。

既往研究证实，GDM子代易发生行为及精神障碍的相关疾病，主要表现为认知、记忆、语言等能力的下降， 注意力缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）、孤独症谱系障碍（autism spectrum disorders，ASD）、抑郁症等发病率较正常人群增加［5-8］。许多学者对子代ASD 及ADHD疾病展开了病理机制的探讨，认为在发育的关键时期，母体高血糖通过促进子代海马中晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）及其受体的形成而引起炎症，解除了对凋亡水平的调控，从而影响海马神经的发生，降低细胞增殖和存活率［9］。海马在联想学习和记忆中发挥着至关重要的作用，已有确切证据表明海马结构异常与抑郁症以及焦虑症等精神障碍疾病显著相关［10-12］。但是对于孕期高血糖是否增加子代抑郁及焦虑等精神功能障碍的风险，尚需要进一步探讨。本研究拟通过GDM模型小鼠探究宫内高糖环境对子代成年期行为及神经精神功能的影响，并初步分析海马神经元发生在该疾病模型中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8 周龄、体质量18～22 g 的C57BL/6J 雌性小鼠购自重庆医科大学动物中心。在实验开始前均适应性饲养1 周。小鼠饲养于独立通气笼盒（IVC）系统的动物房，自由饮水和标准饮食。动物房温度22 ℃～24 ℃，湿度40%～60%，光照12 h。

1.2 主要试剂与仪器

试剂：AIN-93G标准饲料（LFD）、D12451高脂饲料（HFD，美国Research Diets 公司），维持饲料（NFD，北京华阜康生物科技股份有限公司），D-葡萄糖（美国Sigma 公司），人胰岛素（Novolin R，40 U/mL，丹麦Novo Nordisk公司），SYBR-Green（美国Med Chem Expresss公司），4%多聚甲醛固定液（北京索莱宝公司）。

仪器： 血糖试纸及血糖仪（英国Nova Biomedical 公司），PCR 仪（美国Thermo 公司），旷场实验箱、高架十字迷宫、高架零迷宫、悬尾实验箱、强迫游泳仪器（美国ANY-MAZE公司）。

1.3 妊娠期糖尿病小鼠模型的建立

8 周龄C57 雌性小鼠共12 只，随机分为GDM 组和对照组，分别予以HFD 和LFD 饮食，单独饲养1周后，将雌性小鼠和雄性C57 小鼠进行合笼（按照1∶1 比例），次日晨8:00 检查雌性小鼠阴道栓，将检查到阴道栓（即受孕成功）的雌鼠分笼单独喂养（记为E0.5d），其后均给予相应饲料。孕鼠自然妊娠至分娩，待F1小鼠出生时，记录窝产仔数及出生体质量。子代鼠给予正常维持饮食喂养至18 周，进行行为学实验，实验结束后立即处死小鼠并收集海马组织。

1.4 口服葡萄糖耐量实验及胰岛素耐量实验

1.4.1 口服葡萄糖耐量实验 孕鼠分别于E0.5d、E11.5d 及E16.5d 行口服葡萄糖耐量实验（oral glucose tolerance test，OGTT）。早晨8 点更换干净饲养笼，禁食6 h，禁食期间饮水自由，下午2 点开始实验。称重，测空腹血糖水平，按0.1 mL/10 g 给予20%的D-葡萄糖溶液灌胃，测定灌胃后30 min、60 min、90 min、120 min的血糖值。

1.4.2 胰岛素耐量实验 胰岛素耐量实验（insulin tolerance test，ITT）检测时间及准备工作同OGTT。实验开始前，称重，测空腹血糖水平，经腹腔注射0.5 U/kg 胰岛素溶液，注射后15 min、30 min、60 min、120 min后测定各时间点的血糖值。

1.5 行为学实验

1.5.1 开放旷场实验 对饲养至18周子代鼠按其性别分组（n=12）分别进行行为学实验，在安静弱光照射环境进行，实验前提前3 h将小鼠带进实验室适应环境。实验开始后将小鼠从饲养笼取出后迅速放置于实验箱中央区域，并立即离开。采用ANY-Maze公司行为学分析软件自动记录小鼠在箱体内活动，时长为5 min。

1.5.2 高架十字迷宫实验 实验开始前提前适应环境，实验开始后将小鼠从饲养笼中取出并将其放在仪器中央区域，小鼠面向开臂。采用ANY-Maze公司软件自动跟踪记录小鼠运动轨迹，时长为5 min。

1.5.3 高架零迷宫实验 实验开始前提前适应环境，实验开始后将小鼠放在高架零迷宫封闭小巷中心。采用ANY-Maze 公司软件自动跟踪记录小鼠运动轨迹，时长为5 min。

1.5.4 强迫游泳实验 实验开始前先进行适应性游泳，然后将小鼠从水桶中取出，烘干。实验开始后，将小鼠轻轻提起放置于水面上，并迅速离开。采用ANYMaze公司软件记录小鼠不动时间和游泳时间，时长为5 min。实验结束后将动物取出，烘干再放回鼠笼。

1.5.5 悬尾实验 实验开始前提前适应环境。实验开始时，取长约17 cm胶带将小鼠尾部固定至悬挂杆上，其中胶带一端约2 cm部分连接到尾部。仪器离地高度为20 cm，放置完成后迅速安静离开。采用ANY-Maze公司软件记录小鼠不动时间，时长为5 min。1.5.6 糖水偏好实验 实验开始前，小鼠分笼至单笼饲养，并且在笼中放置2 个饮水瓶。实验前期让小鼠适应环境及双水瓶3 d，每天测量水的摄入量。实验正式开始后，将左侧饮水瓶中纯净水更换为1%蔗糖溶液，其余同适应期一样。最后统计纯净水及蔗糖溶液摄入量并计算糖水偏好。

糖水偏好（%）=［蔗糖溶液消耗量/（蔗糖溶液消耗量+纯净水消耗量）］×100%。

1.6 海马组织分离及病理学观察

于行为学实验结束后采用10%水合氯醛腹腔注射对小鼠进行麻醉，麻醉后处死。将脑组织放置在生理盐水中，按照其解剖结构分离完整海马组织，随即置于4%多聚甲醛保存。

将4%多聚甲醛固定的海马组织包埋于石蜡中。石蜡切片后分别进行苏木精-伊红（hematoxylineosin，H-E）染色、镀银染色，脱水封片，在光学显微镜下观察并拍照。

1.7 实时荧光定量PCR实验

使用TRIzol提取海马组织总RNA，并使用MCE反转录试剂盒，将RNA 反转录为cDNA。使用SYBRGreen 荧光试剂盒进行实时定量PCR （real time quantitative PCR，RT-qPCR），分别检测海马区域多巴胺（dopamine，DA）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、脑源性神经因子（brain-derived neural factor，BDNF）及cAMP 反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB） 相 关 基 因 的 表 达（Drd1、Htr2α、Bdnf、Creb1）。其中引物由北京擎科生物合成（表1）。

表1 RT-qPCR引物（5′→3′）Tab 1 Primer sequence for RT-qPCR（5′→3′）

1.8 免疫荧光染色

将海马组织石蜡切片经封闭和破膜后加入胶质纤维酸性蛋白（GFAP）兔一抗（1∶200）、神经元核抗原（NeuN）兔一抗（1∶200），置于湿盒中，4 ℃静置过夜。第2日用PBS洗涤3次后再次封闭，随后滴加二抗后室温放置2 h，再次使用PBS 洗涤，结束后滴加4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），最后将其吸走并洗涤3次。荧光切片放荧光显微镜下观察并拍照，结果使用Image J软件统计。

1.9 统计学方法

使用GraphPad Prism 8 软件进行数据分析。数据以±s形式表示。多组间比较采用单因素方差分析；2 组间差异采用独立样本t检验进行分析。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高脂饮食诱导GDM模型

按照图1A 方法建立GDM 模型，分别于E0.5d、E11.5d、E16.5d 进行OGTT 以及ITT。结果显示：与对照组相比，HFD 组母鼠E0.5d 体质量、窝产仔数以及胎鼠出生体质量，差异均无统计学意义（图1B～D）。HFD组E11.5d，E16.5d空腹血糖值较对照组上升，且差异具有统计学意义（P=0.015，P=0.042；图1E）。E0.5d，HFD组小鼠OGTT各时间点（0 min、30 min、60 min、90 min、120 min）血糖值、OGTT血 糖AUC 值、ITT 各 时 间 点（0 min、15 min、30 min、60 min、120 min）血糖值、ITT血糖AUC值与对照组相比差异均无统计学意义（图1F、I）。E11.5d，HFD 组OGTT 时间点血糖水平较对照组明显上升，AUC 值同样具有差异，差异具有统计学意义（P=0.000；图1G）；在予以胰岛素后60 min、90 min、120 min 血糖水平较对照组上升，ITT 血糖AUC 值同样上升，差异具有统计学意义（P=0.015；图1J），提示HFD 组小鼠出现糖耐量异常。E16.5d，HFD 组小鼠OGTT 血糖值在30 min、60 min 上升，血糖AUC值明显高于对照组，差异具有统计学意义（P=0.000；图1H）；ITT 各时间点血糖水平及AUC 值较对照组上升，差异具有统计学意义（P=0.006；图1K）。以上结果提示HFD 组小鼠在孕前及怀孕初始糖耐量正常，而在中晚孕期才开始出现糖耐量异常，表明小鼠模型与人GDM 发病特征类似，GDM 动物模型诱导成功。

图1 高脂饮食诱导GDM模型Fig 1 High fat diet induced GDM model

2.2 GDM不导致子代成年鼠焦虑症

分别对GDM 组及对照组18 周子代鼠进行行为学实验。实验通过行为学软件监测小鼠5 min 活动区域并通过热成像呈现，研究发现GDM 组与对照组在中心区域及周围区域活动次数差异均无统计学意义；按照子代性别分组进行统计，发现组间差异仍无统计学意义（图2A～C）。高架十字迷宫实验显示GDM 子代鼠活动力上差异不具有统计学意义（图2D），统计小鼠开放臂活动次数结果显示2 组差异不具有统计学意义，子代性别间差异同样不存在统计学意义（图2E、F）。高架零迷宫实验同样显示2组无论是活动力还是开放臂活动次数的差异均不具有统计学意义（图2G～I）。综上，GDM不导致子代成年鼠焦虑症。

图2 GDM与成年子代鼠焦虑症无关Fig 2 GDM not associated with anxiety disorders in adult offspring mice

2.3 GDM与子代成年鼠抑郁症相关

实验前，各组运动力差异不具有统计学意义。强迫游泳实验结果显示，GDM 组小鼠不动时间显著增加，主要体现在F1雌性小鼠，2组间结果差异具有统计学意义（P=0.043，图3A）；观察2 组小鼠游泳时间，GDM 组小鼠游泳时间明显减少（P=0.006），F1雄性小鼠组间差异不具有统计学意义（图3B）。悬尾实验同样观察不动时间，发现GDM 组子代鼠不动时间显著增加（P=0.000），F1 雌雄小鼠差异均具有统计学意义（P=0.048，P=0.041；图3C）。抑郁症典型症状为快感缺失，表现为糖水偏好百分比的下降。本实验结果显示，GDM 组子代鼠糖水偏好百分比明显下降（P=0.001），且差异主要体现在F1 雌性小鼠（P=0.000；图3D）。以上行为学实验均提示GDM 组成年子代鼠表现为抑郁倾向，且F1 雌性小鼠抑郁症状更为明显。

为进一步探索GDM 与子代小鼠抑郁症的相关性，行为学实验后收集F1 雌性小鼠海马组织进行抑郁症相关基因mRNA 验证。RT-qPCR 结果显示GDM组Drd1（图3E）、Htr2a（图3F）、Bdnf（图3G）表达量较对照组明显下降，差异具有统计学意义（P=0.020，P=0.002，P=0.003），Creb1在GDM 组表达下降，但差异不具有统计学意义（图3H）。该结果进一步说明GDM 与子代抑郁症相关，且主要表现在子代雌性小鼠。

图3 GDM与成年子代鼠抑郁症相关Fig 3 GDM associated with depression disorders of adult offspring mice

2.4 GDM影响F1代雌性小鼠海马神经元发生

为探究海马在GDM 致子代雌性小鼠抑郁倾向中的影响，采用H-E 染色及镀银染色观察F1 雌性小鼠海马组织结构形态。海马组织病理分析可见，GDM组海马组织视野内海马体神经细胞形态规则，排列整齐密集，胞核大而圆，呈均匀淡蓝色或蓝色，核仁清楚，细胞质丰富，层次及细胞线清晰，较对照组未见明显异常（图4A、B）。

图4 GDM不改变子代小鼠海马组织结构Fig 4 GDM not affecting the hippocampal structure of offspring mice

既往研究表明海马神经元的发生参与了抑郁症发病机制，因此，对F1 雌性小鼠海马组织进行免疫荧光检测神经元及星形胶质细胞。结果显示：GDM 组子代鼠海马区域NeuN 呈阳性免疫反应的神经元细胞数目明显下降，与对照组差异具有统计学意义（P=0.005；图5A、B）；GFAP 阳性的星形胶质细胞数目明显下降，同样差异具有统计学意义（P=0.030；图5C、D）；提示海马组织内神经元及星形胶质细胞数目下降。以上结果表明海马组织神经元发生减少可能是GDM孕妇子代抑郁症的潜在机制。

图5 GDM影响小鼠海马神经元发生Fig 5 GDM affecting hippocampal neurongenesis

3 讨论

妊娠期血糖水平升高对孕妇及子代均有不利影响，近期表现为肩难产、子痫前期、大于孕龄儿等风险升高，远期表现为II 型糖尿病、高血压、肥胖等发病风险增加［13-14］。事实上，神经发生发育过程易受宫内高血糖及高胰岛素的影响。据报道，孕期高血糖的子代发生中枢神经系统畸形的风险是正常孕妇的15.5 倍［15-16］。然而，人们对于GDM 对子代中枢神经系统发育以及远期行为及精神异常的影响知之甚少。我们通过构建宫内高糖的动物模型，发现母体妊娠期出现糖尿病，其子代雌性小鼠远期易发展为抑郁症，且海马神经元发生下降可能为其神经病理学机制。

受家族遗传因素和后天环境因素的影响，母体糖尿病与人类后代神经发育和精神疾病相关性的研究具有挑战性。动物模型可用以开展神经发育及精神疾病相关的行为学及功能学研究［17-18］。因此，高脂喂养啮齿动物诱导GDM 模型是研究宫内高糖环境与后代神经发育潜在机制的理想模型［19-20］。既往研究利用此动物模型发现GDM 子代易表现出神经发育异常及精神障碍，主要表现在认知、记忆、语言等能力的下降以及患ASD、ADHD 的风险上升［19，21］，该结论也在人类几项大型队列研究中得到验证［22-23］。母亲GDM 对子代其他精神疾病的影响研究较少，有报道称，其与子女抑郁、焦虑、精神分裂症的风险增加有关［17，24-25］。本研究也发现子代在情绪状态方面表现异常，其主要为抑郁倾向而非焦虑倾向。关于GDM 与后代情绪障碍方面的研究仍存在争议，其原因可能是除宫内高糖环境影响外，其他诸如母体遗传因素、家庭因素及社会环境因素等混杂因素也参与其中［17，26-27］。由此看来，从动物模型着手，在排除社会环境及家庭因素等混杂因素后，探讨GDM 子代远期情绪障碍更具严谨性，对未来临床上展开相关性研究具有指导意义。

此外，我们结果显示母体高糖环境下，子代雌性小鼠抑郁倾向表现突出。目前临床尚未有该方面报道，仅有基于动物模型的相关结论。KINNEY 等［28］通过LashleyIII迷宫和抑制性回避任务实验发现GDM子代雌性小鼠在长期学习和记忆方面能力下降。HUERTA-CERVANTES 等［29］发现GDM 大鼠模型后代表现为焦虑样行为，且成年雄性子鼠焦虑程度较雌性低。本研究结论与HUERTA-CERVANTES 等研究存在差异，可能是由于GDM 模型上的差异，其研究使用的是链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的大鼠GDM 模型。综上，糖尿病宫内环境可能对子代中枢神经系统发育的影响具有性别差异性。既往研究显示GDM 可通过表观遗传学的方式影响子代中枢神经系统发育［30-32］，最近研究指出该影响还可能存在跨代效应［33］。因此，我们猜测表观遗传学机制可能为GDM 致雌性小鼠发展为抑郁症的潜在原因。未来可以采用遗传学中的双生子模型考察表观遗传学机制所致的性别差异，这也是我们下一步需要探讨的方向。

海马是边缘系统的重要组成部分，在学习记忆、情绪管理和内脏调控中发挥重要作用。长期以来，海马是抑郁症和应激反应研究的重点脑区［34］。本课题组研究发现GDM 子代雌性小鼠海马结构未发生改变，但其神经递质及脑源性神经因子表达显著下调。其原因可能为GDM 的雌性后代抑郁症仅表现为轻度的情绪障碍，并非重度抑郁症自杀患者所表现出的海马组织结构紊乱及体积减少等异常改变［35-37］。有趣的是，我们对雌性小鼠海马神经元及星形胶质细胞染色时，发现其神经元发生显著下降。其机制可能为宫内代谢环境异常影响了神经信号传导通路、突触可塑性，从而影响神经元和神经胶质细胞的生长、增殖、分化和凋亡，最终影响了后代神经发育。这也是本课题组将来致力探索的研究课题之一。

综上所述，本研究表明GDM 成年子代小鼠表现为抑郁症倾向，其中海马可能参与其病理机制过程，其机制及意义需要进一步研究。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All the authors disclose no relevant conflict of interests.

伦理批准和动物权利声明/Ethics Approval and Animal Right

本研究涉及的所有动物实验均已通过重庆医科大学科学伦理委员会的审核批准（文件号2017-030-2）。所有实验过程均遵照《实验动物标准、守则和福利》的条例进行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Scientific Ethics Committee of Chongqing Medical University（Approval Letter No. 2017-030-2），and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines ofLaboratory Animal Standards，Code and Welfare.

作者贡献/Authors'Contributions

吴侠霏、方婕参与了实验设计；余昕烊、漆洪波参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The study was designed by WU Xiafei and FANG Jie.The manuscript was drafted and revised by YU Xinyang and QI Hongbo.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-12-01

·Accepted：2022-03-16

·Published online：2022-04-28