GANT61诱导结肠腺癌细胞凋亡的作用及其机制

剧 一，赖继超，薛伟彩

1.河北工程大学医学院(河北 邯郸 056038) 2.河北中医学院(河北 石家庄 050200) 3.河北省中医院肛肠外科(河北 石家庄 050013)

近年来，随着人们饮食习惯的改变，结直肠癌的发生率呈上升趋势[1]。目前结直肠癌的治疗多采取以手术、放化疗等为主的综合治疗，但是化疗药物疗效差、毒副作用较大，治疗效果不理想，随着分子肿瘤学的快速发展，如今肿瘤的靶向治疗越来越得到人们的重视[2]。靶向治疗技术在多种肿瘤治疗上已经取得了较大的进步，研究表明异常激活组织中某些信号转导通路将会引起肿瘤的发生，Hedgehog(Hh)信号转导通路在肿瘤的增殖、侵袭和迁移中发挥重要作用，Gli参与肿瘤发生发展的机制涉及多种途径中的靶基因表达来诱导，通过其转录激活在肿瘤的发生发展发挥重要作用，涉及肿瘤包括头颈癌、肺癌、乳腺癌等[3-4]。针对既往结肠腺癌靶向治疗研究不多，本研究通过在结肠腺癌LOVO细胞中Gli1和Gli2被抑制剂GANT61处理后的表达情况来探讨其作用机制，旨在为临床结肠腺癌的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料GANT61购自德国Merck公司，人结肠腺癌细胞系LOVO购自APTT细胞库，胎牛血清购自Sigma公司，RPMI1640培养液购自迈新公司，蛋白分析试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，Gli1兔抗人多克隆抗体、Gli2鼠抗人单克隆抗体、Fas鼠抗人单克隆抗体、GAPDH鼠抗人单克隆抗体、Bcl-2鼠抗人单克隆抗体和Caspase-3兔抗人单克隆抗体及ECL化学发光试剂盒购自迈新科技。

1.2方法

1.2.1 细胞培养 于10%胎牛血清和青-链霉素各100 μg/mL的RPMI1640培养液中培养结肠腺癌LOVO细胞。

1.2.2 凋亡相关蛋白采用Western blot方法进行检测 将细胞转染48 h后取出，PBS洗涤细胞3次；加蛋白提取液和蛋白酶抑制剂，将提取液放置于4℃离心机中以12 000 rpm离心20 min。取离心后的上清液转移到新的EP管中，标明分组；使用BCA试剂盒检测，一抗Gli1(1∶1 000)、一抗Gli2(1∶250)、一抗Fas(1∶250)、一抗Bcl-2(1∶250)，一抗GAPDH(1∶10 000)，4 ℃摇床孵育过夜，每次10 mL分别加入羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶20 000)，ECL试剂发光后暗室曝光显影，Image软件检测蛋白条带的表达，实验重复3次[5-6]。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 将细胞培养于25 cm2的培养瓶内，待其生长良好后，更换培养液，加入不同浓度的GANGT61(10、20 μmol/L)作用LOVO细胞，同时设立对照组(不加GANT61)，PBS液洗涤，固定，PI染色，流式细胞仪测定荧光强度，应用Expo32ADC进行数据分析，计算细胞凋亡率，实验重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞Fas、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达 将细胞置入2%胎牛血清的培养基中，分别加入不同浓度的GANT61(0、10、20 μmol/L)作用LOVO细胞24 h，PBS洗涤细胞2次，调整每份样品细胞数为1×106个/mL，每份样品中分别加入鼠抗人Fas、Bcl-2和兔抗人Caspase-3抗体，PBS洗涤2次，再分别加入二抗，常温静置30 min，用PBS洗涤2次，流式细胞仪检测其蛋白含量，平均荧光强度来表示蛋白量，实验重复3次。

2 结果

2.1Westernblot检测结肠癌细胞LOVO中蛋白表达与对照组比较，GANT61可以下调LOVO细胞Gli1(F=509.791，P=0.000)、Gli2(F=475.072，P=0.000)和Bcl-2(F=534.335，P=0.000)蛋白表达，差异均有统计学意义；增加Fas蛋白表达，差异有统计学意义(F=9 433.507，P=0.000)，且具有剂量依赖性，见图1。

注：与DMSO组比较，*：P<0.01。

2.2流式细胞术检测细胞凋亡不同浓度GANT61作用于LOVO细胞后凋亡率3组间比较差异显著，有统计学意义(F=960.768，P=0.000),20 μmol/L GANT61作用于LOVO细胞24 h后细胞凋亡率(25.01±0.64)%，10 μmol/LGANT61作用组细胞凋亡率(15.62±0.59)%，两组比较差异显著(q=27.359,P<0.01)，20 μmol/L GANT61作用组细胞凋亡率(25.01±0.64)%与0 μmol/LGANT61作用组细胞凋亡率(3.78±0.55)%，两组比较差异显著(q=61.855，P<0.01)，10 μmol/LGANT61作用组细胞凋亡率与0 μmol/LGANT61作用组比较差异显著(q=11.840，P<0.01)，见图2。

注：与DMSO组比较，*：P<0.01。

2.3流式细胞术检测结肠癌LOVO细胞Fas、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平GANT61可以剂量依赖性下调LOVO细胞中Bcl-2蛋白表达水平，3组间比较差异有统计学意义(F=46.624,P<0.01)，10 μmol/LGANT61作用组Bcl-2低于0 μmol/LGANT61作用组(q=8.359，P<0.01)，20 mol/LGANT61作用组Bcl-2低于10 μmol/LGANT61作用组，差异比较有统计学意义(q=5.173，P<0.01)；GANT61上调LOVO细胞中Fas蛋白表达水平，三组间比较差异有统计学意义(F=66.815,P<0.01)，10 μmol/LGANT61作用组Fas高于0 μmol/LGANT61作用组，差异比较有统计学意义(q=47.360，P<0.01)，20 mol/LGANT61作用组Fas高于10 μmol/LGANT61作用组，差异比较有统计学意义(q=9.635，P<0.01)；GANT61上调LOVO细胞中Caspase-3蛋白水平，三组比较差异有统计学意义(F=257.427,P<0.01)，10 μmol/LGANT61作用组Caspase-3表达水平高于0 μmol/LGANT61作用组，差异比较有统计学意义(q=15.491，P<0.01)，20 mol/LGANT61作用组Caspase-3表达水平高于10 μmol/LGANT61作用组(q=16.591，P<0.01)，见表1。

表1 流式细胞术检测不同浓度GANT61作用LOVO细胞24 h细胞中Fas、Bcl-2及Caspase-3蛋白表达水平

3 讨论

Hh信号通路主要由多种成分构成，主要包括Hh配体、Ptch、Smo、Gli以及下游靶基因等构成，其通路的异常活化在肿瘤形成和侵袭转移等恶性生物学特性的维持中发挥重要作用，针对其通路的靶向抑制也成为抗肿瘤治疗的热点。Gli包括3种活化形式，活化的Gli1和Gli2能够调控相关靶基因的转录，影响细胞生长增殖和细胞凋亡，从而导致异常组织的发生，甚至肿瘤的发生发展，可见Gli1和Gli2在细胞的自我更新和细胞凋亡中发挥重要作用[6-8]。

细胞凋亡是调节人体正常发育不可缺少的一种机制，一旦该机制出现紊乱时可能导致肿瘤的发生发展。因此探寻诱导肿瘤细胞凋亡的药物为抗肿瘤研究提供新的思路。GANT61作为Gli基因的抑制剂，能够抑制Gli等转录因子的活性，对Gli下游的多种基因进行调控，阻断SHH通路信号和促进肿瘤细胞凋亡，从而起到抗肿瘤的作用[9-10]。Bcl-2家族在细胞凋亡调控中起关键作用，研究表明[11-12]Bcl-2蛋白水平的高低与凋亡直接相关，Bcl-2高表达可以通过抑制凋亡调控从而影响细胞凋亡。Fas作为一种分子受体，是一种跨膜糖蛋白，Fas可特异性地与FasL结合，在Fas/FasL系统介导的细胞凋亡信号过程中，形成三聚体，把胞外信号转入胞内，介导细胞凋亡，其表达异常与肿瘤的发生、发展及自身免疫性疾病密切相关[13]。本研究结果表明，与对照组比较，GANT61可以下调LOVO细胞Gli1(F=509.791，P=0.000)、Gli2(F=475.072，P=0.000)和Bcl-2(F=534.335，P=0.000)蛋白表达；增加Fas(F=9433.507，P=0.00)蛋白表达，且具有剂量依赖性。流式细胞术检测结果表明，不同浓度GANT61作用于LOVO细胞后凋亡率3组间比较差异显著(F=960.768，P=0.000)。许尚虞等[14]研究表明不同浓度的GANT61能通过抑制Gli1的表达，下调靶基因Bcl-2的表达，从而明显抑制髓母细胞瘤的增殖活性，达到促进髓母细胞瘤细胞凋亡的作用[14]。与郭丽梅[15]、Helen[16]以及王雷[17]研究结果一致。

Caspase-3是诱导细胞凋亡的最重要因子，是细胞凋亡的启动者和执行者，被激活后，可以使细胞内与细胞周期、DNA核酸复制与转录等相关的酶失活，从而导致细胞凋亡[18-20]。Srivastava等[21]研究发现抑制剂GANT61通过下调Gli1、Gli2蛋白在肉瘤细胞中的表达，上调Caspase3表达，从而增强抗肿瘤细胞作用和促进肿瘤细胞凋亡。本研究结果表明，对于Bcl-2,GANT61可以剂量依赖性下调LOVO细胞中Bcl-2蛋白表达水平，3组间比较差异有统计学意义(F=46.624,P<0.01)，对于Fas,GANT61上调LOVO细胞中Fas蛋白表达水平，3组间比较差异有统计学意义(F=66.815,P<0.01)，对于Caspase-3，GANT61上调LOVO细胞中Caspase-3蛋白水平，3组间比较差异有统计学意义(F=257.427,P<0.01)。Hedgehog-Gli信号通路是与Ruizi[22]研究发现结肠癌细胞Gli1高表达，并能上调肿瘤干细胞样因子的表达，从而增强结肠癌细胞的侵袭力。Varnat等[23]研究转移性结肠直肠癌模型发现，当增强Hh信号通路表达时，结肠直肠癌在体内的转移性生长显著增快。当抑制信号通路表达时，癌症的侵袭力和转移能力下降。Douard等[24]通过RT-PCR分析结肠直肠癌样本Shh及下游Gli的表达发现，Shh及Gli异常高表达。且发现阻断内源性Shh表达后，细胞增殖受抑制。Hh信号通路在结肠直肠癌侵袭、增殖及转移中的作用，为临床提供新的治疗方向[25-26]。

综上所述，GANT61通过下调Gli蛋白表达从而抑制结直肠癌细胞的生长增殖和侵袭能力，提示Gli在结直肠癌的发生发展过程中起重要作用，有可能成为结直肠癌靶向治疗提供新的治疗途径。