基于网络药理学和分子对接探讨多基源品种石韦抗炎作用机制的异同

吕丽娟，王祥培，徐 锋，黄芯琦，钟 可，吴红梅*

1.贵州中医药大学药学院(贵州 贵阳 550025) 2.贵州民族大学民族医药学院(贵州 贵阳 550025) 3.眉山市中医医院(四川 眉山 620010)

石韦为水龙骨科植物石韦(Pyrrosialingua(Thunb.)Farwell)、有柄石韦(Pyrrosiapetiolosa(Christ)Ching)和庐山石韦(Pyrrosiasheareri(Bak.)Ching)的干燥叶，为基源相近的多种源性中药，都具有利尿通淋，清肺止咳，凉血止血的相同功效[1]，临床常应用于泌尿系统疾病[2]。泌尿系统类疾病与炎症的发生发展密切联系[3]，药效学研究表明石韦和有柄石韦均具有抗炎作用[4-5]。尽管药典和文献上收录和报道了不同基源的同属石韦，但品种之间存在个体差异[6]，多基源品种石韦抗炎作用机制的相似性和差异性目前缺乏阐述。网络药理学和分子对接能通过构建和整合“成分-靶标-疾病”多层次网络，分析特定信号节点之间的相互作用关系，高效研究其活性成分,并验证核心靶点与炎症之间的亲和力，从系统、整体角度探索药物与机体的相互作用，有助于阐明多基源品种石韦发挥抗炎作用时多组分和多靶标之间潜在的复杂关系[7]。因此本文从网络药理学和分子对接角度，对多基源品种石韦发挥抗炎作用机制的异同进行研究。

1 方法

1.1药物靶点的预测通过查阅相关数据库(CNKI、PubMed)查找石韦(SW)、有柄石韦(YB)和庐山石韦(LS)的所有成分，通过TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以ADME参数(OB≥30%和DL≥0.18)并结合文献报道的相关药效活性为标准，筛选出候选化合物。

1.2疾病靶点的建立利用人类基因和基因表型综合数据库(OMIM，http://www.omim.org/)与GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，以“Inflammation”为关键词，检索“炎症”相关的靶点，整合所有靶点，删除重复靶点，建立疾病靶点数据集。最后，利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将上述筛选得到的所有靶点转化成UniProt ID格式。

1.3“成分-靶点-疾病”网络的构建将石韦、有柄石韦、庐山石韦和疾病数据库得到的靶点绘制韦恩图，存在于韦恩图交集中的靶点视为多基源品种石韦抗炎的潜在核心靶点。采用Cytoscape 3.6.1软件将药物靶点、炎症靶点和交互蛋白对应的靶点连接成“成分-靶点-疾病”网络。以网络中每个节点的拓扑参数“节点连接度”(Degree)、“节点介度”(Betweenness centrality)、“节点紧密度”(Closeness centrality)的中位数为卡值，选择以上3个拓扑参数值满足分别大于所有点中位数值的靶点，作为多基源品种石韦抗炎的核心靶点。

1.4GOKEGG富集分析将核心靶点导入String数据库(https://string-db.org/)中构建蛋白相互作用网络(PPI network，protein protein interaction network)。通过Cytoscape 3.6.1软件对PPI网络进行可视化分析。采用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行KEGG通路分析和GO(Gene Ontology)生物学过程分析。

1.5分子对接在PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中下载靶点蛋白3D结构pdb格式文件。在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载化合物3D结构的sdf格式。使用DockThor[8]进行分子对接，得到活性成分与关键靶点的对接结合亲和力(Affinity，kcal/mol)，最后通过LigPlot实现可视化。

2 结果

2.1药物靶点的预测通过TCMSP数据库，以ADME参数(OB≥30%和DL≥0.18)并结合文献报道的相关药效活性[9-23]，石韦筛选出26个候选化合物，有柄石韦筛选出22个候选化合物，庐山石韦筛选出13个候选化合物。

2.2交集靶点的筛选根据OMIM、Genecards数据库，查找得到9 928个炎症相关的靶点，并与石韦、有柄石韦和庐山石韦有效成分的相关靶点进行匹配并绘制韦恩图(见图1)；图中炎症与石韦特有的交集靶点39个，炎症与有柄石韦特有的交集靶点8个；炎症与多基源品种石韦相同的交集靶点33个。结果表明多基源品种石韦能通过相同的作用靶点和各自特有的作用靶点调控炎症。

图1 疾病靶点基因与多基源品种石韦靶点匹配的韦恩图

2.3交互网络的构建利用Cytoscape 3.6.1软件将以上96个炎症与石韦的交集靶点，69个炎症与有柄石韦的交集靶点，41个炎症与庐山石韦的交集靶点，通过网络药理学构建出多基源品种石韦防治炎症作用的交互网络。结果表明石韦发挥抗炎药效的潜在活性成分12个，其特有的潜在活性成分有山奈酚-3-阿拉伯呋喃糖苷、高丽槐素、槲皮素，4-o-葡萄糖苷、异热马酮、原儿茶酸、槲皮素；有柄石韦发挥抗炎药效的潜在活性成分21个，其特有的潜在活性成分有植物醇、酞酸二乙酯、十六烷等8个；庐山石韦发挥抗炎药效的潜在活性成分13个。多基源品种石韦相同的活性成分为蔗糖、绿莲皂苷元、β谷甾醇和香草醛酸，见图2，表明多基源品种石韦抗炎潜在活性成分的相似性小，差异性大；其中庐山石韦和有柄石韦抗炎的活性成分较为相似。

图2 多基源品种石韦抗炎作用的“成分-靶点-疾病”交互网络

2.4多基源品种石韦抗炎的直接作用靶点拓扑参数分析结合Cytoscape 3.6.1交互网络分析，筛选多基源品种石韦活性成分相关联的蛋白靶点，以网络中所有蛋白靶标网络拓扑参数的中位数均值作为计算结果，石韦得到3个拓扑参数分别为：2、0.000 5和0.48，有柄石韦得到3个拓扑参数分别为：2、0.001 7和0.454 5，庐山石韦得到3个拓扑参数分别为：2、0.006 2和0.457 6。选择3个拓扑参数值均大于中位数均值的靶点作为多基源品种石韦治疗炎症的核心靶点，最终筛选出石韦56个核心靶点、有柄石韦35个核心靶点、庐山石韦21个核心靶点。通过绘制韦恩图分析，多基源品种石韦相同的核心靶点14个。石韦特有的核心靶点24个，有柄石韦特有的核心靶点4个；表明多基源品种石韦抗炎核心靶点的相似性小，差异性大，见图3。

图3 多基源品种石韦作用靶点拓扑参数分析的韦恩图

采用String数据库中构建PPI network，并在Cytoscape 3.6.1中可视化，构建蛋白互作关系图，见图4～6。网络中的节点代表核心靶点，节点与节点之间的边代表蛋白与蛋白的相互作用，标签颜色随Degree增大而加深。分析结果表明，CASP3、PPARG、RELA等在石韦抗炎的过程中起重要作用；CASP3、PPARG、FOS等在有柄石韦抗炎的过程中起重要作用；ESR1、NOS3、SREBF1等在庐山石韦抗炎的过程中起重要作用。

图4 石韦抗炎作用的核心靶点蛋白互作关系图

2.5GO生物学功能富集分析分别将石韦56个核心靶点、有柄石韦35个核心靶点、庐山石韦21个核心靶点映射到DAVID数据库中，进行生物学功能富集分析，结果共富集得到石韦123条生物过程(Biological Process，BP)，26条细胞组成(Cellular Component，CC)，47条分子功能(Molecular Function，MF)；有柄石韦共富集得到71条BP，14条CC，29条MF；共富集得到庐山石韦33条生物过程BP，10条CC，20条MF。其中多基源品种石韦抗炎参与相同的生物过程20条，石韦抗炎特有的生物过程77条，有柄石韦抗炎特有的生物过程18条，庐山石韦抗炎特有的生物过程4条，说明多基源品种石韦的生物过程有相似性小，差异性大，见图7。

图5 有柄石韦抗炎作用的核心靶点蛋白互作关系图

图6 庐山石韦抗炎作用的核心靶点蛋白互作关系图

图7 多基源品种石韦GO生物学功能富集分析的BP韦恩图

2.6KEGG通路分析分别将石韦56个核心靶点、有柄石韦35个核心靶点、庐山石韦21个核心靶点通过DAVID进行KEGG富集分析，共富集得到石韦46条信号通路，有柄石韦19条信号通路，庐山石韦7条信号通路。其中多基源品种石韦抗炎调控相同的信号通路有胆碱能突触信号通路、神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路；石韦抗炎特有的信号通路有29个；有柄石韦抗炎特有的信号通路有3个；庐山石韦抗炎特有的信号通路有3个；表明多基源品种石韦发挥抗炎作用的信号通路有相似性小，差异性大，见图8。

图8 多基源品种石韦KEGG通路富集分析的韦恩图

2.7关键靶点的分子对接PPI中具有较高Degree值的节点，被认为是关键靶点，本研究石韦和有柄石韦排名前2的关键靶点CASP3、PPARG，以及庐山石韦排名前2的关键靶点ESR1、NOS3，分别与品种多基源石韦抗炎作用交互网络中Degree值排名前10的活性成分分子对接。Affinity<-5.0 kcal/moL，表示有较好的结合活性，且Affinity绝对值越大，配体与受体之间的结合能力越稳定[24]。其中β-谷甾醇、高丽槐素、甲基黄连碱等14个成分的亲和力优于临床药物吲哚美辛。结果显示关键靶点与活性成分结合相对较稳定，与网络拓扑参数的筛选结果基本一致，见表1。

表1 活性成分与关键靶点的分子对接表

3 讨论

多基源品种是中国传统药物的常见现象，也是中药的重要组成部分。目前多基源药材仅研究了不同基源之间的成分、药效存在差异[25-26]，但是其作用机制的异同尚不明确。基于此，本文以多基源品种的石韦为例，通过网络药理学和分子对接，探讨多基源品种作用机制的相似性和差异性。

3.1多基源品种石韦抗炎的作用机制的相似性网络药理学预测的结果表明，多基源品种石韦抗炎的活性成分都具有蔗糖、绿莲皂苷元、β谷甾醇和香草醛酸；分子对接验证结果显示石韦、有柄石韦、庐山石韦多基源品种中的绿莲皂苷元、β谷甾醇与抗炎的靶蛋白结合能力较强；现代研究表明[27]β谷甾醇具有抗炎的作用，绿莲皂苷元可调控炎症反应[28]，与验证结果相符。多基源品种石韦相同的核心靶点有PTGS1、PRSS1、SREBF1、NOS3、AR等14个。研究发现激活雄激素受体(AR)是调节多种炎症标志物的重要因素[29]。通过下调甾醇调节元件结合蛋白1(SREBF1)能发挥抗炎作用[30]。多基源品种石韦抗炎参与相同的生物过程有腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、磷脂酶C激活G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路等20条。多基源品种石韦抗炎调节相同的信号通路有胆碱能突触信号通路、神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路。相关药理研究表明，通过“胆碱能抗炎通路”能减轻脓毒症外周炎症反应[31]。

3.2多基源品种石韦抗炎作用机制的差异性石韦发挥抗炎特有的潜在活性成分为山奈酚-3-阿拉伯呋喃糖苷、高丽槐素、槲皮素，4-o-葡萄糖苷、异热马酮、原儿茶酸、槲皮素。槲皮素可通过抑制炎性细胞因子而发挥抗炎作用，改善早期糖尿病肾病[32]。分子对接结果表明，14个成分和关键靶点具有较强亲和力。说明品种不同，其所含的抗炎活性成分有差异，导致抗炎的靶点、信号通路有差异。石韦抗炎特有的核心靶点为PRKCA、ALOX5、RELA等24个。研究表明5-脂氧酶(ALOX5)催化花生四烯酸代谢产生的白三烯是参与炎症的重要介质，动脉粥样硬化是动脉壁的炎症反应，且ALOX5基因启动子区多态性与人类动脉粥样硬化发病相关[33]。提示石韦品种具潜在特有治疗动脉粥样硬化的作用。糖尿病是一种慢性低水平的全身炎症性疾病，降低转录因子p65(RELA)能发挥抗炎作用，进而改善糖尿病[34]。通过靶向调控蛋白激酶Cα(PRKCA)，能有效治疗2型糖尿病[35]。石韦抗炎特有的信号通路为TNF信号通路、乙型肝炎、细胞凋亡等29个。调节鞘脂信号通路能延缓糖尿病视网膜微血管病变[36]。因此，可推断石韦专注于治疗泌尿系统感染。

有柄石韦抗炎特有的潜在活性成分为植物醇、酞酸二乙酯、十六烷、二氢咖啡酸、癸醛、圣草酚、正十六烷酸、邻苯二甲酸二异丁酯。圣草酚缓解小鼠结肠炎,可能与激活Nrf2/HO-1通路发挥抗炎作用有关[37]，提示有柄石韦具潜在特有治疗结肠炎的作用。分子对接结果表明不同基源，其所含的抗炎活性成分、抗炎的靶点、信号通路有差异。有柄石韦抗炎特有的活性靶点有LPL、NFE2L2、NQO1、GSK3B。王湧涛等[38]研究表明调控LPL能改善糖尿病的糖脂代谢,预防其慢性并发症的发生；并且调控NQO1能治疗1型糖尿病[39]。因此，可推断有柄石韦专注于治疗泌尿系统感染。核因子红细胞2相关因子2(NFE2L2)主要通过NFE2L2-Keap1-ARE信号通路发挥抗炎作用，进而改善主动脉夹层[40]。提示庐山石韦具潜在特有治疗主动脉夹层的作用。有柄石韦抗炎特有的信号通路为PPAR信号通路、催乳素信号通路、雌激素信号通路。催乳素信号通路能通过调节炎症应答从而治疗卒中后抑郁[41]。提示有柄石韦具潜在特有治疗卒中后抑郁的作用。

庐山石韦发挥抗炎特有的信号通路为精氨酸生物合成、cGMP-PKG信号通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。cGMP-PKG信号通路在机体免疫或炎症反应中起着关键性作用，进而发挥延缓结核的发病状态或结核病进展作用[42]。提示庐山石韦具潜在特有治疗肺结核疾病的作用。

综上所述，本文通过网络药理学预测石韦、有柄石韦、庐山石韦多基源品种抗炎的活性成分和作用机制相似性小、差异性较大。多基源品种石韦能通过各自特有的活性成分、核心靶点、信号通路发挥抗炎作用，表明不同基源石韦在治疗炎症相关的疾病有各自不同的侧重点。提示多基源品种石韦在临床上防治炎症时有其各自的特色，要区别对待，本研究为多基源品种石韦的临床使用和开发应用提供了理论基础，也为多基源品种作用机制的阐述提供了新思路。