有柄石韦药材UPLC特征图谱研究

潘礼业，索彩仙，邱韵静，吴佳璇，吴文平，李国卫

(广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

石韦始载于《神农本草经》，列为中品，用药历史悠久[1]。石韦为水龙骨科植物水龙骨科植物庐山石韦Pyrrosiasheareri(Baker) Ching、有柄石韦Pyrrossiapetiolosa(Christ)Ching、石韦Pyrrosialingua(Thunb.) Farwell的干燥叶，味甘苦，微寒，归肺、膀胱经，具利尿通淋、清肺止咳、凉血止血功效[2]。有柄石韦分布在全国大部分地区，主产于四川、湖北、贵州等省[3]。其他常见石韦地方习用品有华北石韦Pyrrosiadavidii(Baker) Ching，收载于地方标准[4]。据文献报道，有柄石韦中主要含有三萜、黄酮类化合物、萜酮类、酚酸类等成分[3]。

目前，针对石韦的产地及基原研究较少[5-7]，而以HPLC指纹图谱对其质量进行评价也主要是针对不同产地或基原药材进行样品间的对比分析，并未深层次的探讨不同产地或基原药材样品之间差异的内在因素，而且石韦中酚酸类成分多，含量差异大，部分酚酸类成分的性质比较接近，利用常规的HPLC很难实现准确、高效的分离与检测。UPLC法具有更强大的分离能力、超快的分离速度及超高的灵敏度等优点[8-9]，同时在缩短分析时间及减少试剂消耗方面也具有很大的应用前景。本研究拟通过对不同产地有柄石韦进行研究，建立有柄石韦超高效液相特征图谱，对有柄石韦、石韦、庐山石韦和华北石韦进行系统区分，并尝试对体现其差异性的内在因素进行探讨，为有柄石韦药材的质量控制提供更科学的参考依据。

1 仪器与材料

Waters H-Class高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；Waters CORTECS T3(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)色谱柱；ME204E万分之一分析天平、XP-26百万分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ500D数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q Direct超纯水系统(美国默克股份有限公司)。

绿原酸对照品(批号：110753-201817；质量分数：96.8%)、咖啡酸对照品(批号：110885-201703；质量分数：99.7%)为中国食品药品检定研究院提供；隐绿原酸对照品(批号：1512701；质量分数：98.0%)为成都普菲德生物技术有限公司提供；新绿原酸对照品(批号：wkq18030107；质量分数：98.0%)、异绿原酸C对照品(批号：wkq1805905；质量分数：98.0%)为四川省维克奇生物科技有限公司提供；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

样品经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为水龙骨科植物庐山石韦Pyrrosiasheareri(Baker) Ching、有柄石韦Pyrrossiapetiolosa(Christ)Ching、石韦Pyrrosialingua(Thunb.) Farwell、华北石韦Pyrrosiadavidii(Baker) Ching的干燥叶，样品信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters Cortecs T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；以甲醇为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，梯度洗脱(0～15 min，7%→15%A；15～18 min，15%→20%A；18～25 min，20%→25%A；25～30 min，25%A；30～35 min，25%→40%A；35～40 min，40%→80%A；40～45 min，80%A)；流速为0.35 mL/min；检测波长为326 nm；柱温为30 ℃；进样量为1 μL。

2.2 对照品溶液的配制

取新绿原酸、咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成质量浓度分别为61.41、17.60、200.11、61.51、54.12 μg/mL的混合对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

取样品粉末(过二号筛)约0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%(体积分数，下同)甲醇25 mL，称定质量，超声处理(300 W，40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密吸取同一供试品(S1)溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，以绿原酸为参照峰，计算得各主要成分相对峰面积RSD值为0.15%～3.15%，相对保留时间RSD值为0.02%～0.17%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 精密吸取同一供试品(S1)溶液，按“2.1”项色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，以绿原酸为参照峰，计算得各主要成分相对峰面积RSD值为0.26%～3.38%，相对保留时间值RSD为0.04%～0.26%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取同一批号(S1)的有柄石韦样品6份，每份约0.5 g，按“2.3”项方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项色谱条件测定，以绿原酸为参照峰，计算得各主要成分相对峰面积RSD值为0.22%～1.42%，相对保留时间RSD值为0.05%～0.20%，表明方法重复性良好。

2.5 特征图谱建立与分析

2.5.1 特征图谱建立与特征峰归属 取20批有柄石韦药材，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行进样检测，记录色谱图，分别得到20批样品的特征图谱，以CDF格式依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)软件，以S1药材作为参照图谱，将时间窗宽度设置为0.1 min，以平均数法作为共有模式图生成方式，运用多点校正方法，对20批样品的色谱峰进行手动Mark峰的匹配，建立有柄石韦特征图谱共有模式，得到9个共有峰，结果见图1。通过与对照品进行对比，可以确定峰1为新绿原酸，峰3为咖啡酸，峰4为绿原酸，峰5为隐绿原酸，峰9为异绿原酸C，结果见图2。以峰4绿原酸为参照峰S，20批有柄石韦药材特征图谱的其他9个特征峰相对保留时间RSD值在0.08%～2.86%内，相对峰面积的RSD值在14.64%～46.65%内(见表2)，表明不同产地有柄石韦药材的特征峰对应成分在含量上存在一定波动。

图1 20批有柄石韦药材的特征UPLC图谱

A.混合对照品；B.供试品；1.新绿原酸；3.咖啡酸；4.绿原酸；5.隐绿原酸；9.异绿原酸C。

表2 20批有柄石韦药材特征图谱的相对峰面积

2.5.2 相似度分析 根据国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)软件，分析了20批不同产地的有柄石韦药材的相似度，结果见表3。可见，20批有柄石韦特征图谱的相似度范围在0.982～1.000，表明不同产地的有柄石韦具有较高的相似度，说明有柄石韦整体质量稳定，具有很好的一致性。

表3 有柄石韦药材特征图谱相似度结果

2.5.3 系统聚类分析 运用SPSS 22.0软件对20批有柄石韦进行系统聚类，以欧氏距离平方和为维度，分析结果见图3。可见，当判断距离为10时，20批有柄石韦被分为2类：S1～S3、S8～S10、S14～20聚为一类，即重庆与贵州的样品聚为一类；S4～S6、S11～S13聚为一类，即四川广元样品为一类。当欧氏距离为5时，20批药材被分为4类：Ⅰ类包括S1～S3、S7、S14、S15、S17，即重庆产样品与1批贵州样品聚为一类；Ⅱ类包括S8～S10、S16、S18～S20，即贵州与一批重庆聚为一类；Ⅲ类包括S4～S6，即四川青川聚为一类；Ⅳ类包括S11～S13，即四川旺苍聚为一类。除S7、S16外，其余聚类结果与产地分布相符，表明产地气候环境对所产药材质量有一定影响，S7、S16的差异可能为产地采收加工等因素导致。

2.5.4 偏最小二乘判别分析(PLS-DA) 依据聚类分析结果，对不同产地的5组样品进行PLS-DA分析，结果见图4。可见，该PLS-DA模型，R2X(cum)=0.979，R2X(cum)=0.81，Q2(cum)=0.501，均大于0.5，说明模型稳定可靠，可用于不同产地石韦样品的区分；数据的分类算法中PLS-DA的效果较好，可使5种样本点完全被分开，相互之间未出现交叉的情况，且全部样品均位于95%可信区间之内。采用变量重要性投影值(variable importance in project，VIP)筛选体现5个不同产地样品质量差异的标志物，其中VIP值大于1的成分包括5个，分别为峰1(新绿原酸)、峰2、峰3(咖啡酸)、峰8、峰9(异绿原酸C)，这些成分是体现5个不同产地有柄石韦样品间成分差异的主要标志性成分，其余峰VIP值小于1，对样品的区分影响较小，结果见图5。

图3 聚类分析结果

图4 PLS-DA得分图

2.5.5 特征图谱的应用 取庐山石韦S24-S28和S31、华北石韦S21-S23和S30、石韦S29，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行进样检测，记录色谱图，得到图6-图8。结果显示，石韦的4个基原(石韦、有柄石韦、庐山石韦、华北石韦)的特征图谱具有明显差异。6批庐山石韦的特征图谱表明，不同地区庐山石韦间的特征图谱具有共性，其图谱重合度较高；同样，4批华北石韦的特征图谱共性明显，重合度较高。有柄石韦具有11个共有峰，华北石韦有16个共有峰，庐山石韦有13个共有峰，石韦有12个共有峰，不同石韦基原间的共有峰差异较大，峰1(新绿原酸)、峰2、峰4(绿原酸)、峰5(异绿原酸)为不同基原的共有成分。不同基原的石韦样品中，华北石韦的图谱信息最丰富，峰12～峰19均为华北石韦的独有成分；有柄石韦的成分最简单，峰30为其独有成分；峰20～峰26为庐山石韦的独有成分；峰27～峰29为石韦的独有成分；另外，峰10为有柄石韦、华北石韦、庐山石韦的共有成分，基原为石韦的样品中未检测出该成分；峰3为有柄石韦、华北石韦的共有成分，基原为庐山石韦、石韦的样品中未检测出该成分。

图5 8个化学成分的VIP值

图6 6批庐山石韦UPLC特征图谱

图7 4批华北石韦UPLC特征图谱

A.有柄石韦; B.华北石韦; C.庐山石韦; D.石韦

3 讨论

3.1 分析方法的优化

比较了乙醇、70%乙醇、稀乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇6种提取溶剂，结果显示甲醇、乙醇、70%乙醇作为提取溶剂时，峰形较差，70%甲醇、50%甲醇、稀乙醇的提取效果较接近，结合色谱峰的总特征峰与称样量比值、色谱峰分离效果结果来看，最终选取50%甲醇作为提取溶剂。比较不同检测波长，结果显示在326 nm波长下，色谱基线噪音比较低，特征响应值较高，色谱信息比较完全，故选择326 nm作为检测波长。

3.2 特征图谱的分析

本研究通过建立了20批不同产地的有柄石韦药材的超高效液相特征图谱，超高效液相与传统的高效液相色谱相比分析时间较短，提高了效率，特征图谱不仅能够在一定程度上反映有柄石韦的整体性，也能反映出其特异性；通过相似度评价分析得到20批药材特征图谱相似度均>0.98，各产地间亦均表现出很高的相似度，说明药材质量总体较为稳定，能反映产地真实情况；聚类分析结果显示样品基本可以按产地进行聚类，个别批次未与产地聚类，或因受采收加工影响导致；偏最小二乘判别分析与聚类分析，能互相支持佐证，不同地区的有柄石韦整体表现出很高的相似性，且具有各自内在的区别。

3.3 不同基原样品的比较

本研究在建立有柄石韦特征图谱的基础上，对4种不同基原的石韦样品进行了比较，通过图谱的直观分析，可以明显区分不同石韦基原。其中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸为不同石韦基原样品的共有成分，提示酚酸类成分可能为不同基原石韦药材的物质基础之一，可能也是导致不同石韦基原的药理药效一致的因素。但不同基原的石韦样品其特征图谱差异较大，华北石韦与2015年版《中国药典》上收载的3个基原(石韦、有柄石韦、庐山石韦)区别明显，成分最为丰富，具有16个共有峰，8个特有成分。《中国药典》收载的3个法定基原中，石韦和有柄石韦则表现出较高的相似性，具有8个共有峰，有柄石韦中仅有2个成分在石韦中未检出，石韦中则有4个成分在有柄石韦中未检出；庐山石韦则在15 min后的图谱中表现出与石韦及有柄石韦的明显差异。据文献报道，石韦与有柄石韦2个基原的性状较为接近，庐山石韦则在性状则与前两者具有较大差异[6]，结合本研究的结果，说明这3个基原的性状差异与成分差异具有高度的一致性。

本研究通过在建立有柄石韦特征图谱的基础上，对不同基原的石韦样品进行了对比分析，其结果科学、可靠，为石韦药材的质量研究提供了新方法。本研究仅对不同基原石韦的样品进行了对比分析，并未对其差异成分进行确证，下一步可通过LC-MS/MS技术对不同基原石韦的差异成分进行研究，进一步揭示不同基原石韦的差异物质基础。