基于维生素D探究补肾方药改善心肌缺血再灌注损伤的作用机制

洪秋语,招浩熙,于海洋,陈云志

贵州中医药大学(贵州 贵阳 550025)

急性心肌梗死(AMI)是世界上造成残疾和死亡的主要疾病之一[1]。溶栓和经皮冠状动脉介入手术是目前治疗AMI的主要手段[2]。然而，这些干预手段对恢复血流灌注的时间、速率均有苛刻的要求，若超出人体的适应限度则有加剧心脏组织损伤，加强心肌功能障碍，加重心肌梗死面积的风险，这种后续的损伤效应被学术界称为心肌缺血再灌注损伤(MIRI)。心肌细胞的凋亡是MIRI的最终结果，但其过程受Bcl基因家族(Bcl-2、Bax)、Caspase蛋白家族(Caspase-3)、炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化物酶3(Prdx3)、血红素加氧酶(HO-1)、一氧化氮(NO)、细胞色素(Cyto)与胶原蛋白等多种因素的共同作用。这些因子共同促进了本病的发生。维生素D可以通过干预多种活性介质，抑制心肌细胞凋亡，从而在MIRI中对心肌细胞发挥重要的保护作用[3]。

我国传统中医药在治疗MIRI中得到广泛应用，并展现出良好的治疗效果。在传统中医理论中，MIRI归属于“胸痹”“心痛”“心悸”等范畴，其病机多以痰瘀互结、心肾不交、气血阴阳虚损为关键，属本虚标实之证。故临床上多以活血化瘀、补肾宁心、益气温阳等方法治疗MIRI。现代药理研究发现，中医补肾方药对MIRI治疗卓有成效，但具体作用机制尚未达成共识。课题组前期研究表明，补肾方药与人体内维生素D相关因子的表达及药理作用具有极大的相似性。本文基于信号通路角度从MIRI、维生素D、补肾方药三者关系进行探讨，明确补肾方药对MIRI的作用机制。

1 中医药干预MIRI相关信号通路

1.1酪氨酸激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)信号通路JAK/STAT信号通路是在细胞内传递信号的重要途径，由4个JAKs和7个STATs组成。在MIRI过程中，磷酸化的JAK1和JAK2将激活STAT1和STAT3，进而调节氧化应激反应及下游相关蛋白，对心肌细胞凋亡有着十分重要的影响[4]。然而STAT1和STAT3对心肌细胞的作用具有巨大的差异：STAT1的激活能促进心肌细胞凋亡，STAT3的激活则抑制心肌细胞凋亡[5]。

黄芪皂苷IV能下调MIRI大鼠磷酸化与上调STAT1(p-STAT1)磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达，降低血液中乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，以此发挥保护心肌细胞的作用[6]。双参通脉颗粒(由人参、黄芪、丹参等组成)能激活JAK2/STAT3信号通路，调节Bcl-2、Bax蛋白表达，减少MIRI大鼠心肌细胞凋亡[7]。

1.2磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路PI3K/Akt信号通路是细胞生长和存活的关键信号转导路径。PI3K是一种磷脂酰肌醇激酶，Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PI3K磷酸化产生磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)，进而促进Akt磷酸化。作为MIRI的重要信号途径，PI3K/Akt信号通路能通过抑制氧化应激反应、改善线粒体功能障碍等方式，抑制MIRI的发生[8]。

北五味子乙素能提高大鼠PI3K/Akt信号通路表达，升高总蛋白激酶B(PKB)、NO及SOD水平，抑制氧化应激，从而减少MIRI对组织的病理损伤[9-10]。肉苁蓉苯乙醇苷能激活大鼠PI3K/AKT信号通路，调节大鼠心肌组织中GSK-3β、GSH-Px、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cyto C的表达，提升线粒体功能，降低心肌细胞凋亡指数，抑制大鼠MIRI引起的细胞凋亡[11]。

1.3丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路MAPKs是一组丝氨酸-苏氨酸激酶，主要由细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)等组成。MAPKs可调控细胞的凋亡、分化和增殖，在MIRI进程中发挥关键作用[12]。

肉桂酸能升高磷酸化EPK1/2(p-ERK1/2)水平，下调Bax表达，进而减少心肌细胞凋亡，对MIRI大鼠的心肌细胞起到保护作用[13]。淫羊藿苷和刺五加皂苷B 能下调MIRI模型大鼠p38MAPK和JNK信号通路表达，下调心肌组织中磷酸化p38(p-p38)和磷酸化JNK(p-JNK)水平，减少线粒体功能障碍，使心肌细胞凋亡率明显降低，进而保护心脏[14-15]。

1.4核转录因子E2相关因子2/抗氧化反应元件(Nrf2/ARE)信号通路Nrf2/ARE信号通路是抗氧化应激主要的信号途径。Nrf2是一种基本的亮氨酸拉链转录因子，而ARE是一个特异的DNA启动子结合序列。在MIRI过程中，Nrf2/ARE信号通路能通过抵抗氧化应激，抑制心肌细胞凋亡，减少MIRI的病理损害[16]。

人参Rb3能激活Nrf2信号转导途径，上调Nrf2 mRNA和HO-1mRNA的水平，抑制心肌肌钙蛋白I(c Tn I)、IL-6和TNF-α的表达，参与心肌组织抗氧化和抗炎作用，减少MIRI对心肌细胞的损伤[17]。参附汤有效成分能通过Nrf2信号通路的转录，上调Prdx3水平，减少活性氧(ROS)生成和MDA含量，降低MIRI对心肌细胞损伤程度[18]。

1.5内皮型一氧化氮合酶/一氧化氮(eNOS/NO)信号通路eNOS/NO信号通路是参与硝化应激的重要信号通路。一氧化氮合酶(NOS)是一种同工酶，分为神经型一氧化氮合酶(nNOS)、eNOS以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)三种亚型。研究表明，eNOS/NO信号通路通过减轻硝化应激反应，抑制心肌细胞凋亡，降低MIRI程度[19]。而iNOS的激活会诱导细胞凋亡，从而加剧MIRI[20]。

养心定悸胶囊(地黄、黑芝麻等为主要成分)有效成分可以有效上调磷酸化eNOS(p-eNOS)和抑制磷酸化iNOS(p-iNOS)的产生，促进适量NO在心肌中发生保护作用，使其发挥改善MIRI的作用[21-22]。地黄饮子通过促进NOS mRNA表达，提高血清和心肌组织的NO含量，显著减少心肌梗塞损害，达到抗MIRI的作用[23]。

1.6Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)信号通路TLR4/NF-κB信号通路是炎症的经典信号传导途径[24]。TLR4活化后进一步激活NF-κB，调节炎症反应。而IκB是NF-κB的抑制蛋白。在MIRI中，调节TLR4/NF-κB信号通路能抑制炎症反应和心肌细胞凋亡，在对保护心肌细胞的过程中扮演着重要的角色[25]。

人参皂苷Rg1能通过抑制MIRI大鼠TLR4/NF-κB信号通路的表达，调节TNF-α、IL-1β、p65、IκB的表达，抑制炎症反应，从而缓解MIRI[26]。石斛提取物能下调TLR-4、NF-κB p65、MDA及ROS表达，抑制MIRI大鼠心肌细胞凋亡率，从而减轻MIRI[27]。

2 维生素D在MIRI中的作用

维生素D是一种脂溶性维生素，主要为维生素D2和维生素D3，其中维生素D3可以在肾脏中激活为其活性形式1,25(OH)2D3，也可称为骨化三醇[28]。维生素D受体(VDR)及相关基因(CYP24A1、CYP27A1及CYP27B1)等对维生素D发挥作用具有重要的意义[29]。研究显示，维生素D可调节上述通路，对组织发挥保护作用。具体而言，1,25(OH)2D3通过JAK/STAT途径抑制辅助性T淋巴细胞1(Th1)细胞分化和细胞因子产生来抑制炎症反应[30]；1,25(OH)2D3能减弱脂多糖诱导的内皮细胞炎症反应，其具体机制可能是对PI3K/Akt 信号通路的抑制作用[31]；维生素D可抑制靶向MAPK途径抑制棕榈酸酯诱导的巨噬细胞促炎细胞因子的释放[32]；维生素D3通过激活Nrf2信号以促进组织修复[33]；1,25(OH)2D3通过上调内皮素-1(ET-1)/eNOS 表达来减弱血管重塑和缺血[34]；合成维生素D类似物介导TLR4/NF-κB通路，显著降低组织中性粒细胞和巨噬细胞浸润以及趋化因子、促炎细胞因子的水平[35]。

研究显示，机体内维生素D的水平不足会增加心血管疾病发生的风险[36]。在MIRI过程中，JAK/STAT、PI3K/Akt、MAPKs、Nrf2/ARE等信号通路能调节氧化应激反应，eNOS/NO信号通路能抑制硝化应激反应，TLR4/NF-κB信号能加重炎症反应。维生素D能调节以上多种途径，进而减轻MIRI带来的病理损害。维生素D可以通过减少ROS和活性氮(RNS)的生成，抑制氧化应激和硝化应激，减轻炎症反应，进而达到减缓心肌细胞凋亡的作用[37]。VDR的激活能够有效减轻MIRI大鼠的心肌损伤，缩小心肌梗死的面积，提升左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)水平，进而改善心肌功能[38]。以上结论提示，维生素D可能通过调节不同信号通路，抑制氧化应激、硝化应激、炎症反应等损伤效应，减少心肌细胞凋亡，从而改善MIRI。

3 中医补肾方药可能通过调节维生素D来治疗MIRI

课题组在前期研究中提出，维生素D可视为肾精的客观物质基础，维生素D可能是中医补肾方药发挥作用的潜在靶点[39]。中医补肾药主要有五味子、山茱萸、肉苁蓉、肉桂、淫羊藿、刺五加、地黄、黑芝麻、石斛等。补肾方剂主要有地黄饮子、六味地黄丸等。而常见的补气药如黄芪、人参等在现用的中医院校教材《中药学》中未提及补肾功用。但通过查阅文献，发现这些补气药具有补肾功效在古代文献中有相应论述，如黄芪在《本草纲目》里记载到“其气味甘，微温，无毒……补丈夫虚损，五劳羸瘦，益气，利阴气。主虚喘,肾衰耳聋”；又如《本草新编》谓人参“人参，味甘，气温、微寒、气味俱轻……能入五脏六腑，无经不到，非仅入脾、肺、心而不入肝、肾也……入肾者十之三耳”[40]。研究发现[41-42]，黄芪、人参等中药可治疗诸多以肾虚为基本病机的疾病如原发性骨质疏松症等。同时这些药物多种有效成分对维生素D及相关因子也具有良好的调节效果[43-44]。可见，补气药如黄芪、人参等亦可发挥补肾与调节维生素D及相关因子的作用。

通过上述文献检索总结，发现中医补肾方药针对MIRI具有良好的调节治疗效果。其中，黄芪、人参、丹参、淫羊藿、五味子等中药与维生素D及其相关因子的表达有密切联系：黄芪具有调节维生素D缺乏大鼠血清25(OH)VD3、成纤维生长因子-23(FGF-23)、Klotho基因的水平[45]；人参及其有关活性成分可通过对维生素D轴的调节发挥治疗骨质疏松、动脉粥样硬化、2型糖尿病、结肠癌和乳腺癌等相关疾病的功效[44]；丹参提取物能提高维甲酸诱导骨质疏松大鼠骨组织的VDR mRNA水平[46]；淫羊藿苷能降低D-半乳糖致衰老模型大鼠的血清25(OH)D3与1,25(OH)2D3水平和肾脏的CYP27B1与VDR表达[47]；五味子及其有效物质通过维生素D轴来发挥治疗多种疾病的作用[48]。含有黄芪、人参、附子等成方具有调节25(OH)D3、VDR、CYP27B1表达的作用[49-51]。

故此推测中医补肾方药可能以维生素D作为发挥治疗MIRI功效的靶点。

4 总结

中医补肾方药能通过介导不同信号通路，抑制心肌细胞凋亡，从而缓解MIRI所致的心肌功能障碍。同时，上述补肾相关中药及成方在维生素D及其相关因子表达的过程中联系密切，它们亦能通过调节多种信号通路在MIRI中发挥重要作用。而维生素D对上述信号通路均有调节作用。根据上述三者的关系推测，中医补肾方药可能通过调节维生素D及其相关因子的表达，干预多种信号通路，抑制心肌细胞凋亡，进而在MIRI中对心肌细胞发挥重要的保护作用。