苗药弩药方最佳配伍筛选研究

成 雪，张永萍,2,3*，徐 剑,2,3，杨芳芳,2，刘 耀,2,3

1.贵州中医药大学(贵州 贵阳 550025) 2.贵州省中药民族药炮制与制剂工程技术研究中心(贵州 贵阳 550025) 3.国家苗药工程技术研究中心(贵州 贵阳 550025)

苗医药是祖国极具民族特色的文化瑰宝，苗药弩药源自古代苗人射杀动物涂于弓箭上的剧毒药物，起效快，有“见血封喉”之效[1]。后世经减毒后，与针合用，称为弩药针，常用于风湿疾病的治疗。贵州毕节与黔东南地区仍有使用[2-3]。由于苗族无特定文字，弩药方的记载较少，仅以古歌、传说、神话故事等形式口传心授[1]，这使弩药方的组成各不相同。为了固定苗药弩药组方，本研究以均匀设计试验结合经典的镇痛抗炎试验进行组方配伍筛选，为苗药弩药方的后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1动物KM雄性小鼠，18～22 g；SD大鼠，雄性，180～250 g(重庆腾鑫实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(军)2018-0011)。给予充足的水和鼠料，自由饮水摄食，适应性饲养1周。

1.2药物试剂与仪器川乌、草乌、天南星等药材(购于贵阳市花果园太升药材市场)；50%乙醇(实验室自制)；扶他林(批号：VP1235，北京诺华制药有限公司)；硫化钠(批号：2018050106，天津市致远化学试剂有限公司)；冰醋酸(批号：20180727，重庆江川化工有限公司)；二甲苯(批号：20181101，重庆川东化工有限公司)。智能热板仪(BHS-6B，北京中慧天诚科技有限公司)；游标卡尺(上海量具刃具厂)。

1.3方法

1.3.1 均匀设计 以专著和期刊中报道的弩药组方为依据，统计分析各药味频数，见表1。

频数最多的10味药为：生草乌、川乌、天南星、半截烂、雪上一枝蒿、八角枫、三分三、蜂毒(蜂房、马蜂窝、大马蜂)、半夏及麝香，其中，蜂毒和麝香为贵重药材，不易获得。为固定弩药组成，以临床常用方(处方6)为基础，配以专著和期刊中频次多的药味为备选药物。选择的药物类别为：生草乌、八角枫、黑骨藤、大血藤、透骨香、川乌、天南星、半截烂、三分三、雪上一枝蒿。

用DPS数据处理系统，选择U11(1110)均匀设计表，以生草乌、川乌、天南星等10味药为因素，各设11个水平，设置初始量为0 g，最大量是常用量的2倍，以第6个水平为每味药常用量[11-13]。按照U11(1110)均匀设计表安排试验，得不同配伍弩药11组，见表2。按试验安排表，称取各药物，用1 200 mL 50%乙醇密封浸泡30 d，每天振摇3次，过滤，定容至1 000 mL，置于阴凉避光处备用。

1.3.2 抗炎镇痛实验

1.3.2.1 小鼠醋酸扭体实验 小鼠喂养1周后，随机分为14组，每组8只，分别为溶剂对照组、空白组、均匀设计组(N1～N11)，阳性组。8%硫化钠小鼠腹部脱毛，N1～N11组涂药(0.1 mL/只)[7]至腹部，阳性组在腹部涂抹芝麻粒大小的软膏，溶剂对照组给予50%乙醇，空白组不做处理，1次/d，连续7 d，末次给药30 min后腹腔注射0.6%冰醋酸(0.2 mL/只)，观察小鼠15 min内扭体次数及潜伏时间，计算各组镇痛百分率[14]，比较各组扭体次数和潜伏时间差异。

1.3.2.2 小鼠热板法实验 实验前测定小鼠基础痛阈值(小鼠起始在热板仪上到舔后足的时间，痛阈值应在5～30 s内为合格)，选取合格小鼠，随机分为14组，分组按1.3.2.1项方法。N1～N11组取5 mL药液至鼠笼，润湿笼底，取4只小鼠放至同一笼中，30 min后放回原鼠笼；阳性药组4足涂抹芝麻粒大小的扶他林软膏，1次/1 d，连续给药7 d，末次给药后，溶剂对照组给予50%乙醇，空白组不做处理。测定小鼠30、60、90 min的平均痛阈值，计算各组痛阈提高率，比较各组间痛阈值差异。

痛阈提高率=(给药后痛阈值-基础痛阈值)/基础痛阈值×100%。

镇痛百分率=(溶剂组扭体次数-给药组扭体次数)/溶剂组扭体次数×100%。

1.3.2.3 鸡蛋清致炎实验 分组按1.3.2.1项方法。将脱脂棉(2 cm×2 cm)用胶布固定于大鼠右后脚掌，N1～N11组取0.7 mL药液吸附于脱脂棉上，观察大鼠防其咬掉脱脂棉，1 h后拆掉[15]，阳性组在足部涂抹芝麻粒大小的扶他林软膏，溶剂对照组给予50%乙醇，空白组不做处理。给药后立即测大鼠右后足的厚度，为致炎前足厚度[9]。30 min后足皮下注射10%新鲜鸡蛋清溶液(0.2 mL/只)致炎，分别在致炎0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h测右后足厚度，计算致炎前后差值即为足肿胀度，比较各组差异。

1.3.2.4 二甲苯致耳肿胀实验 分组按1.3.2.1项方法。N1～N11组小鼠均匀涂药(0.1 mL/只)于左耳，阳性组在左耳涂抹芝麻粒大小的扶他林软膏，溶剂对照组给予50%乙醇，空白组不做处理。1次/1d，连续7 d。末次给药1 h后，取二甲苯(0.05 mL/只)涂于左耳致炎。30 min后，小鼠脱颈处死，沿耳廓基线剪取两耳，于同一位置用8 mm打孔器取两侧耳片，称重，两耳差值为肿胀度[16]，比较各组肿胀度差异，并计算抑制率。

抑制率=(空白组肿胀度-给药组肿胀度)/空白组肿胀度×100%。

2 结果

2.1小鼠醋酸扭体法实验与空白组比较，阳性组与均匀设计各组(N1～N11)小鼠的扭体次数明显减少(P<0.05)；均匀设计组(N1～N7)小鼠在潜伏时间上明显延长(P<0.05)。与溶剂对照组比较，均匀设计各组(N1～N8，N10)小鼠的扭体次数明显减少(P<0.05)；均匀设计组(N1～N7)小鼠在潜伏时间上明显延长(P<0.05)。阳性组、均匀设计各组(N1～N11)镇痛率均在一定程度上提高了小鼠镇痛率，见表3。

2.2小鼠热板法实验与空白组比较，30 min时，阳性组、N6组、N7组小鼠痛阈值明显提高(P<0.05)；60 min时，阳性组、N6组、N9组、N10组小鼠痛阈值明显提高(P<0.05)；90 min时，阳性组、N2组、(N5～N10)组小鼠痛阈值明显提高(P<0.05)。与溶剂对照组比较，30 min时，阳性组、N7组小鼠痛阈值明显提高(P<0.01)；60 min时，阳性组、N6组、N9组、N10组小鼠痛阈值明显提高(P<0.01)；90 min时，阳性组、N9组、N10组小鼠痛阈值明显提高(P<0.01),见表4。

2.3鸡蛋清致炎实验与空白组比较，30 min时，阳性组与均匀设计组(N1～N11)大鼠足肿胀明显减轻(P<0.05)；1 h时，阳性组与均匀设计各组(N1～N9)组、N11组大鼠足肿胀明显减轻(P<0.05)；2 h时，阳性组、N1组、N2组、N4组、N7组、N11组大鼠足肿胀明显减轻(P<0.01)；3 h时，阳性组、N1组、N2组、N7组、N11组大鼠足肿胀明显减轻(P<0.05)；4 h时，阳性组、N1组、N2组、N5组、N7组、N8组、N11组大鼠足肿胀明显减轻(P<0.05)。与溶剂对照组比较，30 min时，阳性组与均匀设计各组(N1～N9)、N11组大鼠足肿胀明显减轻(P<0.05)；1 h时，阳性组与均匀设计各组(N1～N8)组、N11组大鼠足肿胀明显减轻(P<0.05)；2 h时，阳性组、N1组、N2组、N4组、N7组、N11组大鼠足肿胀明显减轻(P<0.05)；3 h时，阳性组、N1组、N2组、N7组、N8组、N11组大鼠足肿胀明显减轻(P<0.05)；4 h时，阳性组、N1组、N2组、N5组、N7组、N8组、N11组大鼠足肿胀明显减轻(P<0.05)，见表5。

2.4二甲苯致耳肿胀实验与空白组比较，阳性组、N1组、(N3～N5)组、(N7～N11)组小鼠耳肿胀明显缓解(P<0.05)；与溶剂对照组比较，阳性组、N1组、(N3～N5)组、(N7～N8)组、(N10～N11)组小鼠耳肿胀明显缓解(P<0.05),见表6。

2.5加权评分结果以耳肿胀度Y1、醋酸扭体次数Y2、足肿胀度Y3和痛阈值Y4为综合评价指标，进行加权综合评分,见表7。计算公式如下：

Y1=(YR1-YN1)/(YR1-YN1)max×100%；

Y2=(YR2-YN2)/(YR2-YN2)max×100%；

Y3=1/5(Y0.5 h+Y1 h+Y2 h+Y3 h+Y4 h)，

Y0.5 h/1 h/3 h/4 h=(YR3-YN3)/(YR3-YN3)max×100%)；

Y4=1/3(Y30+Y60+Y90)，

Y30/60/90=YN4/(YN4)max；

Y=1/4(Y1+Y2+Y3+Y4)。

结果表明：以DPS数据处理系统逐步回归分析综合评分数据，得回归方程：Y=57.671 991 1+0.445 368 289X1-0.140 327 751X2+0.095 357 462 8X3-0.228 722 341 1X4+0.718 831 448X5+0.650 425 895X6+0.061 4034 144X7+0.002 562 459 527X8+0.172 127 995 9X9-0.448 228 119X10；相关系数r=0.999 999，P=0.003 5，见表8。根据回归方程，综合评分的最佳药物组成为：三分三20 g、川乌40 g、天南星40 g、雪上一枝蒿20 g、八角枫30 g、透骨香100 g、半截烂40 g。

3 讨论

本文对已有专著和期刊报道的弩药方进行整合，以均匀设计法设计出11组不同配伍的弩药组方；将11组不同的弩药组方用50%乙醇浸泡，得到不同的弩药液后，结合实验室常用的经典镇痛抗炎实验，即醋酸扭体法、热板法实验、鸡蛋清致炎实验、二甲苯致耳肿胀实验筛选弩药方；最后以耳肿胀度、醋酸扭体次数、足肿胀度和痛阈值4个指标为综合评价指标，进行加权综合评分，得到最佳弩药处方。

根据现有的相关文献和专著报道，弩药由多种毒性中药组成，本研究筛选出的弩药最佳处方：三分三、川乌、天南星、雪上一枝蒿、八角枫、透骨香、半截烂，都是毒性中药。故还应致力于研究其如何增效减毒，进一步确定弩药作用的有效成分，改善剂型，提高安全性，以便于临床使用。