长时程采血法及儿茶素药代动力学参数研究

陶柏楠，金铮钰，张 钰，万 星,3*

1.湖北民族大学风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室(湖北 恩施 445000) 2.湖北民族大学医学部(湖北 恩施 445000) 3.四川大学华西基础医学与法医学院(四川 成都 610064)

儿茶素类单体以C6-C3-C6为基本骨架，C3环上C2和C3为手性碳原子，由于取代基不同，常见的儿茶素单体有8种：(+)-儿茶素(Catechin,C)、(-)-表儿茶素(epicatechin,EC)、(+)-没食子儿茶素(gallocatechin,GC)、(-)-表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC)、(+)-儿茶素没食子酸(catechingallate,CG)、(-)-表儿茶素没食子酸酯(epicatechingallate，ECG)、(+)-没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechingallate,GCG)与表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)[1]。主要在茶叶以及一些中药材中提取获得[2]，根据其分子式，市面已有合成的单体成品，这一类物质通常具有抗菌[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、抗突变、预防心血管疾病[6]等多种作用。课题组前期在开发抗肝纤维化药物时，从鬼箭羽醇提物中发现儿茶素的效能极高[7]，而现有文献报道EC和EGCG同样具有抗肝纤维化作用[8-9]，但是由于极性大，吸收和生物利用度不高，目前仍然处于改构和研发阶段[10]，由于C取代基上的-OH远少于EGCG，因此，C的药代参数是否更利于成药，本文在前期工作基础上将对C做出药代学参数分析，为药物研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1药品与动物儿茶素(上海源叶生物，LOT：P20O7F23087)；甲醇、乙腈(上海麦克林生化科技有限公司，色谱纯)；5 mL肝素抗凝管(河北鑫乐医疗器械科技股份有限公司)；PE材质动脉插管(北京GLOBALEBO)；PVC材质输液管(河南曙光生物科技有限公司)；新西兰兔(湖北逸挚诚生物科技有限公司，许可证号：SCXK(鄂)2021-0020)。

1.2主要仪器高效液相色谱仪(日本岛津，LC-2030C 3D)；氮吹仪(北京优晟联合科技有限公司，UGC-12M)。

1.3方法

1.3.1 药物的配置 精确称取500 mg的儿茶素，加生理盐水定容到62.5 mL，配成8 mg/mL的溶液，现配现用。新西兰兔耳缘静脉给药剂量为10 mg/kg。

1.3.2 新西兰兔颈总动脉插管 新西兰兔20%乌拉坦5 mL/kg麻醉固定，颈部手术，气管插管，分离颈总动脉鞘，游离颈总动脉至少2 cm长，远心端丝线结扎，近心端动脉夹夹持，在离近心端较近的地方剪一V型切口，按实验分组选取PE管进行深度和浅度插管，用装有肝素的注射器进行封堵，将注射器固定于铁架台上，再移开动脉夹。

1.3.3 新西兰兔颈外静脉插管 采用1.3.2同样方法，分离颈外静脉2～3 cm，按实验要求选取PE或PVC插管进行浅插或者深插，浅插至深插分别为插管从切口处向前推进2、4 cm和至上腔静脉中(6 cm)，每只兔子每种深度每隔1 min采血1次，连采3次。

1.3.4 给药及样品采集 取6只新西兰家兔，实验前12 h禁食不禁水，按照上述方法，用PVC材质插管进行深插，先用抗凝管采2 mL正常血液，然后以10 mg/kg的剂量耳缘静脉注射儿茶素，于给药后2 min、5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、10 h从插管处采血2 mL，静置15 min，3 500 r/min离心10 min，取上清血浆-20℃保存。

1.3.5 儿茶素标准品溶液配置 分析天平精确称取儿茶素，加空白血浆溶解配成200 μg/mL的母液。按梯度稀释法用空白血浆依次稀释成20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156、0.078 μg/mL，再进行样品处理，上机。

1.3.6 样品预处理 标曲的样品取350 μL，加1 575 μL乙腈后，10 000r/min,离心10 min。取1 600 μL上清，氮吹仪吹干，500 μL甲醇复溶上机。采血点的样品取600 μL，加2 700 μL乙腈后，10 000 r/min,离心10 min。取2 800 μL上清，氮吹仪吹干，500 μL甲醇复溶上机。

1.4色谱条件色谱柱：InertSustainC18柱(250 mm×4.6 mm，5μ m)，流动相：0.3%冰醋酸(A)—乙腈(B)，等度洗脱：92%冰醋酸+8%乙腈，流速：0.8 mL/min，柱温：25℃，进样量20 μL，检测波长278 nm[11]。

1.5方法专属性考察考察儿茶素甲醇溶剂，400 μg/mL儿茶素血浆、20 μg/mL儿茶素血浆，第一只新西兰兔2 min采血点样品的色谱图。

1.6方法学考察精密度考察：配置5、1.25、0.3125 μg/mL的标准品各1份，分别同一天上机6次，计算各浓度儿茶素日内RSD。重复性考察：配置5、1.25、0.312 5 μg/mL的标准品各一份，每份样品连续测定3 d，计算日间RSD。稳定性考察：配置5 μg/mL的标准品3份，1份冻融3次，1份室温放置0、6、12 h，1份4℃储存0、7、14 d，分别上机3次，计算RSD。

1.7药代动力学参数测定把时间和浓度输入Das 2.0软件，选择智能分析得出其房室模型，再利用成批数据分析其药代动力学参数，报导统计矩结果。

2 结果

2.1不同材质插管对溶血影响PE材质插管颈动脉采血时会导致严重的溶血，颈静脉采血时，会随着插管深度，流速加快，溶血程度增加，而PVC材质插管时，颈外静脉采血无论插管深浅，都不致溶血，见表1。

表1 不同材料和插管深度对溶血的影响(n=6)

2.2PVC材质插管深度对采血时程的影响药代实验采血时间点是否准确对药时曲线形成影响重大，即对药代参数影响很大，因此，用PVC插管进行颈外静脉插管时，同时记录了采血所需时间。结果显示：采血2 mL，浅插2 cm需(55±5)s完成，中插4 cm需要(31.7±2.9)s完成，深插6 cm(即至上腔静脉)需(12±2)s完成，见图1。

图1 插管深度对采血时间的影响(n=6)

2.3HPLC方法专属性考察在本色谱条件下，儿茶素被分离开，定位清晰不受血浆中杂质的干扰，专属性强，其保留时间约为40.729 min，见图2。

(A:标准品溶于甲醇；B:血浆中400 μg/mL儿茶素；C:血浆中20 μg/mL儿茶素；D:2 min的采样)

2.4HPLC法精密度与重复性考察选取5、1.25、0.312 5 μg/mL的标准品，按照1.3.6方法处理上机，测得峰面积并计算浓度，以相对标准差RSD表示精密度，结果显示：低中高浓度的儿茶素日内RSD<3%，见表2。

表2 HPLC法考察儿茶素的精密度与重复性

2.5HPLC法考察儿茶素稳定性配置5 μg/mL的标准品三份，一份冻融三次，一份室温放置0、6、12 h，一份4℃储存0、7、14 d，冻融、室温放置和4℃储存的RSD(%)分别为：1.91、3.53、1.89，见表3。

表3 HPLC法考察儿茶素的稳定性

2.6标准曲线及儿茶素单剂量静脉注射的药时曲线利用外标法测标准曲线，按照1.3.5方法配置标准溶液，1.3.6方法上机测峰面积，得出峰面积与浓度之间的方程式S=7400.3C-213.28，R2=0.999表明线性关系良好。儿茶素耳缘静脉注射后的药时曲线如图3B，图C和图D为其中3只家兔儿茶素的C(浓度)-t(时间)曲线和对应的LnC-t曲线。

A:标准曲线；B:6只兔浓度-时间曲线；C:每只兔浓度-时间曲线,D:LnC-t曲线。

2.7儿茶素在兔体内的药代动力学参数将血药浓度带入Das 2.0软件。经过计算机模拟，首先进行房室模拟：最佳房室为三室w=1，次佳房室为二室w=1，以三室权重1求得统计矩参数如表4。

表4 儿茶素在兔体内的药代动力学参数

3 讨论

药时曲线准确的前提之一就是采血点的准确和不发生溶血。PE材质的插管不论做静脉采血还是动脉采血，均导致不同程度地溶血，PVC材质插管不会导致溶血。

采血点时程越短，代表该采血点药物浓度更准确，经过实验验证，静脉插管时，插管越深离心脏越近，出血速度越快，能在12 s左右完成家兔2 mL采血。同时预实验提示长时程采血宜用插管采血，耳缘静脉、心脏采血不适合长时程大量采血。

本课题组在研发抗肝纤维化药物时，从鬼箭羽醇提物中提取儿茶素单体，发现儿茶素抗肝纤维化的效能极高[7]，但鉴于同类EGCG同样具有抗肝纤维化功效却由于极性高生物利用度低面临改造等问题，课题组对儿茶素的药代学展开研究，发现AUC值较大，说明儿茶素有一定量吸收，结合药时曲线上浓度迅速降低的表现推测药物可能迅速被代谢成其他物质，需进一步研究分析，但仅存的儿茶素半衰期约7.5 h，该数据对药物口服、静脉注射均有较大优势，同时表观分布容积V较大，远超出血浆量，提示儿茶素主要分布在血浆以外的组织，对治疗实体脏器的疾病优势会更高，该角度也解释为什么儿茶素抗肝纤维化效果好。

总之，从药代学参数出发，开发儿茶素的价值较大，至于儿茶素发挥药效是物质原型还是代谢物有待进一步研究。