模拟肽Gap27抑制缝隙连接蛋白43在帕金森病小鼠模型中的作用

权会会，徐卫星，祁宇泽，李清如，周 辉，黄 婧

(北京大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系，北京 100191)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种神经退行性疾病，运动表现有震颤，僵硬，运动迟缓和姿势不稳，其病理特征是黑质多巴胺(dopaminergic，DA)神经元的进行性丧失，以及形成路易体(Lewy body，LB)和路易神经突(Lewy neurite，LN)[1]。6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)是一种选择性的儿茶酚胺能神经毒素，常用于PD动物模型建立，其化学结构与DA神经递质相似，对DA转运蛋白具有高亲和力，在黑质(substantia nigra，SN)部位注射6-OHDA能够引起黑质-纹状体通路的顺行性病变[2]。

星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞，星形胶质细胞网络在神经退行性病变中起着关键作用[3]。在病理性脑损伤后，星形胶质细胞由静止状态转变为激活状态，但其功能存在争议，据报道A1与A2型激活态星形胶质细胞同时发挥神经保护和神经退行性作用[4]。星形胶质细胞的一个独特特征是它们通过连接蛋白(connexin，Cx)进行细胞间高水平通讯，其中缝隙连接蛋白43(connexin 43，Cx43)作为星形胶质细胞的一种主要缝隙连接蛋白，可形成缝隙连接(gap junctions，GJs)允许细胞质间物质信号传递，或形成半通道(hemichannels，HCs)允许细胞膜内外物质交换[5]。Cx43 GJs与HCs在调节细胞内外谷氨酸、Ca2+、ATP水平中起着重要的生物学功能，与神经元功能障碍和死亡密切相关[6]，在PD进程中发挥着不可忽视的作用。

Cx43蛋白包含4个跨膜区以及2个胞外环[7]，Gap27是Cx43蛋白第二个胞外环的模拟肽，可以抑制Cx43 HCs活性及新的GJs形成[8]。目前已发现Gap27在缺血性脑损伤[9]、伤口愈合[10]等方面的保护作用，其作用机制可能涉及调节Cx43 GJs的解离、内化，或模拟关键的细胞外环序列与未偶联的连接蛋白相互作用，从而破坏互补HCs的对接以减少GJs的数量[8]。此外，Gap27可直接与GJs相互作用从而改变离子通道门控，或改变Cx43蛋白与其他蛋白间的相互作用调节GJs功能[11]。Cx43蛋白的羧基末端是磷酸化作用的区域，易受到蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等激酶的调节，其中PKC介导的Cx43第368位丝氨酸磷酸化(Cx43 phosphorylation at serine 368，Cx43-ps368)蛋白在形成的GJs通道的功能中具有重要调节作用，Cx43-ps368蛋白与Cx43 GJs的组装/拆卸以及降低GJs通透性等过程高度相关[12-13]。此前的研究工作观察到，Gap27在脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)诱导的体外原代神经元-胶质细胞模型中对DA神经元存在保护作用[14]。本研究将进一步观察Gap27在6-OHDA小鼠模型中的作用，并观察Gap27对Cx43蛋白及Cx43-ps368蛋白表达的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物

采用8周无特定病原体(specific pathogen free，SPF)雄性野生型C57BL/6小鼠建立6-OHDA模型。小鼠购自北京大学医学部实验动物科学部，3～4只一笼，自由摄食和饮水，保持人工昼夜12 h/12 h循环，温度(23±1)℃，湿度50%±5%。本研究已通过北京大学生物医学伦理委员会审查(批准号：LA2018282)，符合动物福利伦理要求。

1.2 脑立体定位注射

对小鼠进行双侧黑质注射6-OHDA建立PD动物模型，建模过程参照既往研究[15-16]。将18只小鼠随机分为对照组、6-OHDA组与6-OHDA+Gap27组，每组6只。将小鼠麻醉后，放置在耳鼻梁固定的立体定位支架中。对照组注射0.1 g/L的抗坏血酸盐水1 μL；6-OHDA组注射1 μL的6-OHDA(6-OHDA为2.5 g/L，抗坏血酸盐水为0.1 g/L)；6-OHDA+Gap27组注射1 μL 6-OHDA+Gap27混合溶液(6-OHDA 为2.5 g/L，Gap27为4 g/L，抗坏血酸盐水为0.1 g/L)。药品定向注入双侧黑质，以前囟为原点，向左或向右1.5 mm，向下3.0 mm，深度4.5 mm，定位参照《小鼠脑立体定位图谱》(第三版)[17]。给药时针头以1.5 mm/min的速度下降，以1 μL/min速度给药，给药后静置5 min，将针头以1.5 mm/min的速度抽回。2周后进行心脏灌流取全脑，选择每组内3只小鼠脑组织用于免疫组织化学染色与免疫荧光染色检测，另外3只小鼠取中脑组织，一半中脑用于Western blot检测，剩余中脑用于实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测。

1.3 酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)免疫组织化学染色定量

取脑组织置于4%(体积分数)多聚甲醛溶液固定24 h，30%(质量分数)蔗糖脱水，至脑组织沉底后进行冰冻切片，每片厚度为35 μm，4 ℃保存。取第1、5、10、15、20、25、30片黑质部脑片进行多巴胺神经元标志物TH染色，将脑片置于6孔板中，每孔加入500 μL 3%(体积分数)H2O2，反应10 min后漂洗，每孔再加入500 μL封闭液封闭1 h，加入300 μL TH一抗抗体(1∶1 000)，4 ℃过夜。漂洗后每孔加入300 μL 对应二抗抗体(1∶1 000)，室温孵育1 h。漂洗后加入500 μL亲和素生物素化酶复合物(avidin biotinylated enzyme complex，ABC)，室温孵育1 h。漂洗后入二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色2 min，之后进行梯度脱水，脱水后使用二甲苯透明，中性树胶封片。使用Pannoramic SCAN Ⅱ拍照系统(3DHSITECH公司，匈牙利)和Caseviewer软件(3DHISTECH公司，匈牙利)观察并进行拍摄。由其他2名不知情人员使用Image J软件手动计数SN中TH阳性细胞的数量。

1.4 免疫荧光染色检测Cx43蛋白分布

挑选DA神经元数量较多的2片黑质部脑片，进行星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和Cx43蛋白免疫荧光共染。每孔加入500 μL封闭液5%(质量分数)牛血清白蛋白室温孵育1 h封闭非特异性位点后，然后加入500 μL GFAP(1∶800)和Cx43一抗(1∶150)混合液，4 ℃过夜。漂洗后，加入500 μL荧光标记抗鼠(1∶500)和荧光标记抗兔(1∶500)二抗，室温孵育1 h；漂洗后，将脑片贴在载玻片上，用含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)防荧光淬灭剂封片，徕卡激光共聚焦显微镜(Leica公司，德国)观察、拍摄，Image J软件分析荧光强度。

1.5 Western blot检测Cx43蛋白表达

使用组织裂解液提取中脑组织总蛋白，用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)试剂检测蛋白浓度，取20 μg总蛋白上样，使用10%(体积分数)的分离胶和4%(体积分数)的浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacryla-mide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。电泳后，使用120 mA恒流对聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluo-ride，PVDF)膜转膜2 h。转膜后将PVDF膜置于封闭液中，室温摇床封闭1 h。封闭后4 ℃下分别孵育Cx43一抗(1∶1 000)、Cx43-ps368一抗(1∶1 000)和GAPDH一抗(1∶2 000)过夜。漂洗后，按照一抗类型加入辣根过氧化物酶标记抗兔(1∶1 000)二抗或辣根过氧化物酶标记抗鼠二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h。电化学发光法显色，曝光。Image J软件分析光密度值。

1.6 qRT-PCR检测Cx43信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)表达

使用RNA抽提试剂提取中脑组织总RNA，按说明书配置逆转录体系进行反转录后进行qRT-PCR。以GAPDH为内参照，按2-ΔΔCt法计算6-OHDA组与6-OHDA+Gap27组目标基因相对于对照组的变化倍数。

Cx43基因正引物序列(5′～3′)为：CTGAGTGCGGTCTACACCTG；反引物序列(5′～3′)为：GAGCGAGAGACACCAAGGAC。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 黑质TH阳性神经元变化

6-OHDA组黑质TH阳性神经元数较对照组显著降低，表征模型建立成功[16]。在注射6-OHDA后，为确定抑制Cx43蛋白对黑质DA神经元细胞死亡产生的影响，通过计数TH阳性神经元的数量表示DA神经元细胞死亡程度。注射6-OHDA 2周后，与对照组相比，6-OHDA组小鼠黑质中TH阳性神经元数量减少了72.3%±0.02%(P<0.01)。6-OHDA+Gap27组较对照组小鼠黑质中TH阳性神经元数量减少了54.6%±0.04%(P<0.01)，6-OHDA+Gap27组TH阳性神经元数量与6-OHDA组相比，为后者的(1.64±0.16)倍(P<0.05，图1)。

A, TH immunoreactive neurons of control group(DAB staining, n=3); B, TH immunoreactive neurons of 6-OHDA group(DAB staining, n=3); C, TH immunoreactive neurons of 6-OHDA+Gap27 group(DAB staining, n=3); D, relative number of TH positive neurons in substantia nigra.* P <0.05, # P <0.01.TH, tyrosine hydroxylase; 6-OHDA, 6-hydroxydopamine.

2.2 Cx43蛋白及Cx43基因表达变化

为分析Gap27对Cx43表达的影响，对中脑组织Cx43蛋白及Cx43mRNA表达量进行检测。Western blot检测结果显示6-OHDA组Cx43蛋白含量显著高于对照组和6-OHDA+Gap27组(图2)，为对照组的(1.68±0.07)倍(P<0.01)，为6-OHDA+Gap27组的(1.44±0.07)倍(P<0.05)。6-OHDA+Gap27组Cx43蛋白含量略高于对照组(图2)，为对照组的(1.17±0.17)倍，差异无统计学意义。qRT-PCR结果显示，三组Cx43mRNA表达量差异无统计学意义(图2)。

对星形胶质细胞标志蛋白GFAP和Cx43蛋白进行免疫荧光共染色，结果显示黑质部位Cx43蛋白含量变化与Western blot结果一致(图2)。6-OHDA处理后Cx43蛋白含量增加，6-OHDA组蛋白含量是对照组的(1.41±0.08)倍(P<0.01)，是6-OHDA+Gap27组的(1.22±0.07)倍(P<0.05，图2)。

A, the differences of Cx43 and Cx43-ps368 protein content among groups(n=3); B, relative expression of Cx43 protein, Cx43-ps368 protein, and Cx43-ps368/Cx43; C, relative expression of Cx43 mRNA(n=3); D, immunofluorescence co-staining of astrocytes(green)and Cx43 protein(red)in substantia nigra(n=3); E, relative expression of Cx43 protein fluorescence intensity.* P <0.05, # P<0.01.6-OHDA, 6-hydroxydopamine; DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.3 Cx43-ps368蛋白含量变化

有研究显示Cx43-ps368蛋白水平升高与Cx43 GJs通讯水平降低相关[18]。为研究Gap27是否引起Cx43-ps368蛋白含量变化，使用Western blot对Cx43-ps368蛋白进行检测，结果显示：6-OHDA组Cx43-ps368蛋白含量较对照组与6-OHDA+Gap27组降低，为对照组的37.5%±0.09%(P<0.05)，6-OHDA+Gap27组的40.6%±0.10%(图2)；在Cx43-ps368蛋白与总Cx43蛋白比值方面,6-OHDA组Cx43-ps368蛋白占比显著低于对照组与6-OHDA+Gap27组(图2)，分别为对照组的22.6%±0.06%(P<0.01)，6-OHDA+Gap27组的28.8%±0.08%(P<0.05)。

3 讨论

本研究旨在探讨模拟肽Gap27抑制Cx43蛋白在6-OHDA诱导的PD小鼠模型中对DA神经元死亡及对Cx43表达的影响。目前在PD中Cx43蛋白的研究多为观察性研究[19-22]，并且缺乏对DA神经元状态的观察，Cx43蛋白在PD中的作用有待明确，因此，本研究通过加入模拟肽Gap27来观察其在6-OHDA诱导的PD小鼠模型中的作用。本研究结果显示，注射6-OHDA后小鼠DA神经元数量较对照组显著减少，Gap27则降低了黑质DA神经元损失，这提示Gap27在黑质部位对DA神经元存在保护作用。此外，Gap27显著逆转了6-OHDA引起的Cx43蛋白含量增加与Cx43-ps368蛋白含量降低，但未发现Gap27对Cx43mRNA水平和Cx43蛋白空间分布的影响。

本研究结果中6-OHDA组中脑Cx43蛋白含量增加，与之前在6-OHDA、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrapyridine，MPTP)、鱼藤酮等神经毒性物质诱导的动物纹状体及星形胶质细胞中发现Cx43蛋白含量增加的结果一致[19-22]。本研究中模拟肽Gap27可逆转6-OHDA引起的Cx43蛋白含量增加，并减少DA神经元数量损失，提示Cx43蛋白过表达可能存在神经毒性。本研究还发现6-OHDA引起中脑Cx43-ps368蛋白含量降低，Gap27则减弱了这一变化。据报道Cx43-ps368蛋白可降低Cx43 GJs生物学活性，Gap27维持Cx43-ps368蛋白水平可能是其发挥神经元保护作用的机制之一[18]。本研究中qRT-PCR与免疫荧光染色结果显示Cx43mRNA水平和Cx43蛋白的分布没有受到Gap27影响，在其他Cx43蛋白水平升高的PD动物模型研究中也观察到相同的结果[20]，这可能与Cx43蛋白半衰期较短(t1/2<2 h)，转录翻译处于高表达状态相关[23]，Cx43半衰期短这一特点也使得Gap27可较快发挥抑制作用。由于Cx43mRNA水平没有改变，6-OHDA组Cx43蛋白含量的增加则可能与Cx43-ps368蛋白去磷酸化的转变相关。另外,免疫荧光染色结果显示黑质部位血管区域以及非血管区域Cx43蛋白免疫阳性点都有所增加，此前Charron等[24]发现6-OHDA处理后大鼠纹状体中只观察到血管周围Cx43免疫阳性点增加，但无血管区域Cx43变化不显著。造成结果不同的原因可能有：(1)观察脑区不同，本研究观察脑区为黑质，文献[24]中为纹状体；(2)本研究与文献[24]中使用的6-OHDA剂量不同，导致Cx43免疫阳性点分布不同。

Cx43 GJs与HCs功能及数量的降低可防止过量的有害物质经过星形胶质细胞网络传递，进而减少神经元损伤，综合本研究结果，6-OHDA引起了黑质DA神经元大量死亡、Cx43蛋白增加和Cx43-ps368蛋白降低，模拟肽Gap27则减弱了6-OHDA引起的上述变化，提示6-OHDA引起的Cx43蛋白过表达可能对DA神经元存在神经毒性。Gap27降低Cx43蛋白含量可能间接影响了Cx43 GJs与HCs的组装形成，Cx43-ps368蛋白水平升高可降低Cx43 GJs活性，Gap27的保护作用可能与降低Cx43蛋白表达并维持Cx43-ps368蛋白水平相关。综上所述，本研究通过使用模拟肽Gap27发现了Cx43蛋白及Cx43-ps368蛋白在PD病理机制中的重要作用，为阐明PD的分子机制提供了实验依据。