基于人消化道微生态体外模拟系统观察纳米二氧化钛对肠道菌群的影响

张家赫，史佳琪，陈章健，贾 光

(北京大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系，食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京 100191)

二氧化钛(titanium dioxide, TiO2)作为一种食品添加剂应用已久。1966年，美国食品与药物管理局正式认可TiO2作为食品添加剂，最高允许添加量为1%[1]。我国国家健康卫生委员会(原卫生部)在食品添加剂使用标准(GB2760-2014)中规定TiO2可以作为食品添加剂适量使用，饮料和糖果中最高允许添加量为10 g/L。但随着时代的发展和技术的进步，纳米二氧化钛(titanium dioxide nanoparticles，TiO2NPs)已大量存在于食品级TiO2中，占据总颗粒数的17%～35%[2]。据报道，北京市20～30岁人群每天消化道TiO2NPs摄入量为0.02～3.09 μg/kg[3]。TiO2NPs经消化道摄入可能在人体组织中蓄积，并产生健康风险，如氧化应激、组织病理学改变、致癌作用、遗传毒性、生殖毒性和免疫破坏等[4]，但机制尚未完全明确。此外，TiO2NPs具有良好的抗菌能力，对常见细菌具有抑制生长和杀灭的作用[5-7]，因此，TiO2NPs对人消化道尤其是肠道菌群的影响值得关注。人体肠道菌群对于宿主能量与代谢平衡以及身体健康的影响已经受到科学界广泛关注和探索，人类肠道正常菌群通过多种免疫因子与肠道免疫系统形成动态平衡状态，失衡时可能引起各种负面健康效应。

目前已有动物实验显示TiO2NPs经口摄入可以对肠道菌群产生影响，主要影响乳酸杆菌(Lactobacillus)等厚壁菌门(Firmicutes)细菌的相对丰度[8-13]。然而肠道菌群的组成在物种之间甚至同物种的不同品系之间存在明显差异[14]，导致动物实验结果外推至人体时具有局限性。而体外消化道微生态模拟系统提供了一种可能的直接研究人源肠道菌群的实验方式，常见的体外消化道微生态模拟系统可以分为单相静态、半连续动态和多相连续动态模拟系统。1993年，Molly等[15]提出了人类肠道微生态模拟系统(simulation of human intestinal microbial ecosystem，SHIME)，这种连续动态模拟系统采用5个部分模拟了胃、小肠、升结肠、横结肠、降结肠的微生态，被应用于食品医药[16]、重金属污染[17]等肠道菌群相关研究。各种体外模拟系统不断经历优化和改进，较好地模拟人体消化道微生态，在肠道菌群研究领域有着广阔的发展应用前景。本文参考SHIME等已有模型构建了体外人消化道微生态模拟系统，研究TiO2NPs对人源肠道菌群组成和结构的影响。

1 材料与方法

1.1 TiO2 NPs的理化表征

TiO2NPs购自上海麦克林生化科技有限公司。使用透射电镜(transmission electron microscopy，TEM；JEM-1400，JEOL公司，日本)观察颗粒的形状和平均粒径；通过电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass pectrometry，ICP-MS；IRIS Advantag，美国)检测颗粒纯度；使用X射线衍射仪(X-ray powder diffractometry，XRD；PANalytical’s X’Pert PRO，荷兰)测量晶型；使用BET(Brunauer-Emmett-Teller)法测量比表面积；通过动态光散射(dynamic light scattering，DLS；ZetaSizer Nano ZS90，英国)测量TiO2NPs(1 g/L)的水合粒径和Zeta电位。

1.2 人源肠道菌群提取

参考叶峰等[18]的方法提取和保存粪便菌群。粪便菌群供体为1位健康成人志愿者(24周岁男性，无慢性消化道疾病及其他病史，半年内未服用过抗生素类药物)。取新鲜粪便约5 g加入25 mL磷酸盐缓冲液，混匀后4 ℃静置1 min，取上清液10 mL，4 ℃下1 500 r/min离心3 min，上清液为菌群提取液，放入超净台备用。

1.3 人消化道微生态体外模拟系统构建

1.3.1溶液配置 营养液：脑心浸液肉汤培养基(青岛海博生物)；模拟胃液：氯化钠3 g/L、胃蛋白酶3.2 g/L、36.5%(体积分数)浓盐酸7 ml/L，pH测定为1.40；模拟胰液：碳酸氢钠12.5 g/L、牛胆汁6 g/L、猪胰素粉0.9 g/L，pH测定为8.16。

1.3.2体外模拟流程 本实验构建的模拟系统是在SHIME基础上简化的三相半连续动态模拟系统。模拟过程完整模拟TiO2NPs经口摄入后逐步进入胃、小肠和结肠，并在结肠阶段与肠道菌群相互作用的整个过程。整个模拟过程在同一培养瓶中进行，通过改变液体环境模拟胃、小肠、结肠阶段，因此属于三相半连续动态模拟系统。模拟过程从胃模拟阶段开始，用模拟营养液和TiO2NPs染毒液模拟纳米颗粒和食物混合经口摄入的过程，其被加入到模拟胃液中，而后加入模拟胰液进入小肠阶段，最后加入提前稳定培养的菌液，模拟结肠阶段(图1)。整个体外模拟系统由电热套保证恒温，细胞培养瓶密封并用厌氧产气袋保证无氧环境，培养过程中采用摇床以60～70 r/min模拟肠道蠕动。实验过程在超净台中进行。

TiO2 NPs, titanium dioxide nanoparticles.CNC, computer numerical control.

1.3.3系统稳定性评价 根据培养过程中菌群内主要细菌：肠球菌(Enterococci)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和乳酸杆菌的生长曲线，初步评价系统的稳定性。实验方法如下：取1 mL菌群提取液，在不加TiO2NPs染毒的情况下，按上述体外模拟系统流程培养48 h。在培养的第0、12、24、36、48 h，从体系中吸取菌液，分别接种在肠球菌、大肠杆菌和乳酸杆菌的选择性培养基上，按适宜条件培养后进行细菌计数。胆盐七叶苷琼脂培养基(bile esculin agar，BEA)用来选择性培养肠球菌，伊红美蓝培养基(eosin-methylene blue medium，EMB)用来选择性培养大肠杆菌，乳酸杆菌选择性培养基(Lactobacillusselective agar，LBS)用来选择性培养乳酸杆菌。

1.4 TiO2 NPs染毒

参考人群日常暴露剂量[3, 19]和体外细菌毒性实验结果[20-21]，设置染毒剂量的最低值为20 mg/L，并以5为组距设置中高剂量组。

在胃阶段向模拟系统中加入不同量的TiO2NPs，在结肠模拟阶段加入提前培养稳定的菌液，使最终TiO2NPs的染毒浓度为0、20、100、500 mg/L，继续培养16 h染毒结束。对照组(0 mg/L)和TiO2NPs低(20 mg/L)、中(100 mg/L)、高(500 mg/L)剂量染毒组各设置3个平行样。每个样本均收集1 mL染毒结束时的菌群培养液于冻存管中，短暂放于-20 ℃冰箱后转移至-80 ℃保存待测。

1.5 菌群16S rRNA测序

取1 mL菌液冻干去除水分后采用十六烷基三甲基溴化铵法进行菌群基因组DNA提取，并利用1%(10 g/L)琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。使用稀释后的基因组DNA作为模板，使用合成带有Barcode的特异引物(针对V4区域的515F和826R，针对V3+V4区域的341F和806R)和96孔热循环(HID VeritiTM96-Well Thermal Cycler)PCR仪进行PCR扩增，PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小，并用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒纯化。得到扩增条带后使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用PCR扩增进行文库模板的富集，利用氢氧化钠变性产生单链DNA片段，构建形成Miseq文库。使用Ion S5 XL测序仪进行单端测序，根据荧光信号结果获知Miseq文库中模板DNA片段序列。

1.6 数据分析

数据导出为Fastq格式文件。利用Trimmomatic软件采用滑动窗口对序列进行筛选和保留，利用Flash和Pear软件对具有重叠(overlap)的序列进行拼接，最小重叠区域10 bp，错配率0.1，得到初始文件(Fasta)序列。根据已知数据库(http://www.drive5.com/uchime/uchime_download.html)用uchime方法比对去除Fasta序列的嵌合体，对于未知数据库使用自比对(denovo)方法进行去除，同时去除不合要求的短序列。采用Qiime和vsearch软件进行聚类归组分析，将优质序列(clean tags)聚类分为许多操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)，对97%相似水平下的OTUs进行生物信息统计分析，聚类方法采用uparse聚类法；采用Qiime和Uclust Consensus Taxon Assigner软件对OTUs代表序列在各个水平(界kingdom、门phylum、纲class、目order、科family、属genus、种species)注释其群落的物种信息。

对各样本组学数据进行归一化处理，采用mothur和Qiime软件进行Alpha多样性分析；采用Qiime和R软件进行Beta多样性分析；采用R软件进行单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)和线性判别效应量分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)，根据线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)得分评估各组间的物种差异并寻找组间差异的肠道菌；采用PICRUSt 2.0软件，根据京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)数据库信息，对基因序列的功能丰度进行预测。

其他实验数据使用R软件进行统计分析，使用Shapiro-Wilk正态性检验和Bartlett方差齐性检验，连续变量采用均数±标准差表示。所有实验数据基于同一样本来源的3次生物学重复实验结果。所有检测均为双侧检验，并以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TiO2 NPs表征

TiO2NPs的表征结果显示，TiO2NPs粒径为球形，直径为(25.12±5.64)nm，纯度为99.99%，晶体结构为锐钛矿，比表面积(77.51±0.29)m2/g，在超纯水中水合粒径为(609.43±60.35)nm，Zeta电位为(-8.33±0.22)mV。

2.2 系统稳定性评价结果

选择性培养基培养结果如图2所示。在0～24 h，各类细菌数量随培养时间延长逐渐增加，在24～48 h维持相对稳定，并在48 h时显示出下降趋势(图2)，这说明本模拟系统稳定性良好，在培养24 h时即能达到相对稳定，且稳定状态可以保持24 h。在24 h，BEA显示肠球菌计数达到(1.6±0.85)×107个，EMB显示大肠杆菌计数达到(5.6±0.82)×107个，LBS显示乳酸杆菌计数达到(2.7±1.32)×107个。

本研究中体外消化道模拟系统培养24 h后肠球菌、大肠杆菌和乳酸杆菌数量转化为以10为底的对数值分别为7.17±0.28、7.74±0.07、7.40±0.20。SHIME模型[15]中，培养稳定时对应细菌计数(以10为底的对数值)分别为7.33±0.38、7.69±0.71、6.58±0.78。与SHIME模型相比，本研究所用的体外消化道模拟系统在肠球菌和大肠杆菌计数上相近，初步判断稳定性较好。

2.3 肠道菌群组成分析

2.3.1OTUs聚类分析 OTUs是在系统发生学或群体遗传学研究中，为便于进行分析，人为给某一个分类单元(品系、属、种、分组等)设置的统一标志。通过归类操作(cluster)，共产生223个OTUs。按组分，各样本组共有的OTUs数目为143个，对照组、20 mg/L TiO2NPs剂量组、100 mg/L TiO2NPs剂量组、500 mg/L TiO2NPs剂量组分别具有独特的OTUs数目为2、0、1、3个，TiO2NPs染毒组共有而对照组没有的OTUs有50个(图3A)。按样本分，各样本共有的OTUs数目为87个(图3B)。说明对照组和TiO2NPs染毒组OTUs不同，提示菌种组成存在差异。

The sample names and operational taxonomic units(OTUs)quantity of each part are marked in the figure.Low, 20 mg/L TiO2 NPs; Middle, 100 mg/L TiO2 NPs; High, 500 mg/L TiO2 NPs.

2.3.2物种组成分析 对OTUs代表序列进行对比分析，并在各个生物学分类水平注释其群落的物种信息。根据分类分析结果可以得知样本或样本组间在各分类水平上的分类学对比情况，反映了样本中微生物的种类和相对丰度。基于Unweighted Unifrac距离矩阵，UPGMA方法聚类建树，并将聚类结果与各样品在门、纲、目、科、属水平上的物种相对丰度整合展示为图4。在门水平上，4组均以变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门为主(图4A)。在纲水平上，对照组以γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和Negativicutes菌纲为主，低、中、高TiO2NPs染毒组均以γ-变形菌纲和梭菌纲(Clostridia)为主(图4B)，对照组的各样本彼此间更为接近。在目(图4C)和科(图4D)水平上，TiO2NPs染毒组之间表现出分离的趋势。在属水平上，大肠埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)等细菌在各组间表现出相对丰度的差异(图4E)。

In the proportional bar charts, each color represents a species of bacteria at the corresponding level(the same color represents different bacteria at diffe-rent levels), and the length of each color block represents the relative abundance of the corresponding bacteria.On the left side of the bar charts it is showed the results of clustering each sample according to the similarity degree of strain composition.

2.4 肠道菌群物种多样性分析

2.4.1Alpha多样性分析 群落生态学中研究微生物多样性，通过单样品的多样性分析(Alpha多样性)可以反映微生物群落的丰度和多样性，包括一系列统计学分析指数估计环境群落的物种丰度和多样性。Chao1和Observed species指数主要反映样本的物种丰富度信息，Shannon和Simpson综合体现物种的丰富度和均匀度，PD whole tree兼顾物种丰富度和进化距离。TiO2NPs染毒组的Chao1、Observed species和PD whole tree均显著高于对照组，而对照组在Shannon和Simpson指数上与TiO2NPs染毒组差异无统计学意义，各指数具体分布见图5。

Low, 20 mg/L TiO2 NPs; Middle, 100 mg/L TiO2 NPs; High, 500 mg/L TiO2 NPs.*P<0.01, #P<0.001, vs. control.

2.4.2Beta多样性分析 主成分分析(principal component analysis，PCA)结果见图6A，PCA前两个主成分解释方差的百分比分别为63.15%和14.57%，共计77.82%，图中表现出对照组与TiO2NPs染毒组显著分离。利用偏最小二乘法判别分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)构建模型(图6B)，可见前两个主坐标可解释的方差百分比分别为36.08%和8.62%，共计42.70%，对照组和TiO2NPs染毒组的分离趋势明显可见。以上结果表明，TiO2NPs改变了肠道菌群的beta多样性，使得TiO2NPs染毒组与对照组的菌群结构和组成产生了显著差异。

Low, 20 mg/L TiO2 NPs; Middle, 100 mg/L TiO2 NPs; High, 500 mg/L TiO2 NPs; PC, principal component; PCA, principal component analysis; PLS-DA, partial least squares discrimination analysis.

2.5 差异肠道菌群筛选

采用LEfSe分析可以找到组间在丰度上有显著差异的物种，其结果由原始数据柱状图和分支进化图展示(图7)。以LDA得分>3为标准，共筛出42个在TiO2NPs染毒组和对照组中存在显著差异的细菌种类，其中包括拟杆菌门(Bacteroidetes)，放线菌纲(Actinobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、拟杆菌纲(Bacteroidetes)3个菌纲，拟杆菌目(Bacteroi-dales)、梭菌目(Clostridiales)、乳杆菌目(Lactobacillales)、巴斯德氏菌目(Pasteurellales)4个菌目，拟杆菌科(Bacteroidaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteria-ceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)等9个菌科，拟杆菌属(Bacteroides)、肠杆菌属、肠球菌属、优杆菌属(Eubacterium)等17个菌属以及阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)等8个菌种。

2.6 差异肠道菌群功能预测

利用PICRUSt 2.0软件，根据KEGG数据库，对16S rRNA高通量测序数据进行KEGG基因注释，并预测相关通路和功能。结果提示，共有14种功能和通路具有统计学差异(图8)，包括“氧化磷酸化”“能量代谢”“磷酸盐和磷酸盐代谢”“甲烷代谢”“真核生物中的核糖体发生”“环境适应”“蛋白酶体”“消化系统”“植物-病原相互作用”“传染病：细菌”“免疫疾病”“蛋白质消化吸收”“阿米巴病”“系统性红斑狼疮”等。

The ordinate represents the 14 functions and pathways with statistical differences, and the ordinate shows the corresponding-lgP values.

3 讨论

本研究通过体外消化道微生态模拟方法研究了TiO2NPs对人源肠道菌群的影响。体外模拟系统从液体环境、有机物和无机盐、寄生菌群、外部环境等多方面尽可能地还原人体消化道微生态，具有简便快速、相对廉价、符合医学伦理和可重复利用等优点。目前，体外模拟系统已经在营养学、药理学和食品化学等领域得到认可和广泛应用，但在纳米材料领域还未得到广泛应用[22]。Dudefoi等[23]利用SHIME模型培养人工混合的菌群，发现TiO2NPs对细菌群落影响有限，卵形拟杆菌(Bacteroidesovatus)丰度降低，而耳蜗形梭菌(Clostridiumcocleatum)丰度增加。MET-1菌群是由33种标准细菌混合的用于粪菌移植治疗的模拟菌群，与本研究所用的直接人来源的粪便菌群有所不同。但本研究也同样发现了3种拟杆菌属的细菌(Bacteroidessalyersiae，Bacteroidessp.MarseilleP2653，BacteroidesuniformisdnLKV2)和一种梭菌(ClostridiabacteriumUC5.1-2G4)在对照组和TiO2NPs染毒组之间存在显著的丰度差异，这提示拟杆菌和梭菌可能是TiO2NPs影响的关键人源菌种。体外模拟系统难以完全模拟复杂的体内生理过程，不得不在准确性和易用性之间妥协，这需要在今后的研究和应用中继续优化改进。

TiO2NPs可以改变影响肠道菌群的组成和结构，影响益生菌的相对丰度，进而影响机体代谢和功能。肠道益生菌是一类对宿主有益的肠道细菌，主要包括乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和革兰氏阳性球菌(Gram-positive cocci)。本研究发现肠道益生菌在TiO2NPs染毒组和对照组间存在显著差异，包括乳酸杆菌属和两种双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis，Bifidobacte-riumlongum)。与对照组相比，高剂量TiO2NPs染毒组中乳酸杆菌增加而双歧杆菌减少。在大鼠体内的实验得到了相似的结果[9-10]，但在小鼠中的部分研究则发现乳酸杆菌相对丰度减少或不变[11-12]。此外，在其他实验动物中表现出差异的劳森菌(Lawsonia)或生丝微菌属(Hyphomicrobium)等在本研究中均未被发现。正常人肠道菌群中占比最多的细菌属是拟杆菌属、梭菌属、消化球菌属(Peptococcus)、双歧杆菌属、真杆菌属(Eubacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、粪杆菌属(Faecalibacterium)和消化链球菌属(Peptostreptococcus)[24]，其中拟杆菌属等在本研究中表现出受到TiO2NPs的显著影响。同时，TiO2NPs还可能通过改变肠道菌群影响机体能量代谢和免疫功能。本研究通过PICRUSt功能预测发现，TiO2NPs对肠道菌群的影响可能引起氧化磷酸化等能量代谢改变、系统性红斑狼疮等免疫功能异常以及其他多种代谢和功能变化。TiO2NPs在亚急性和亚慢性动物实验中均可引起免疫炎症反应，导致小肠炎性浸润[9]、上皮细胞形态改变[25]、连接蛋白合成受阻[26]等，并可通过血液循环产生肝、肾、脾等器官损伤[27]。本研究提示，TiO2NPs消化道暴露可能改变人体肠道菌群中的益生菌及其他主要细菌的相对丰度，从而影响人体健康。

综上所述，体外人消化道微生态模拟系统下TiO2NPs可以影响人源肠道菌群的组成和结构，改变其中益生菌等多种细菌的相对丰度，并可能影响机体的代谢和功能。体外人消化道微生态模拟系统在纳米材料消化道暴露后对人源肠道菌群的影响研究中具有较好的应用前景。